人源誘導多潛能干細胞在心血管疾病研究中的應用與挑戰(zhàn)

田 蕾 柳金英 白 蕊 吳福建 張惠敏 謝 璇 蘇聰平 王 青 郭淑貞 王 偉 蘭 峰

2017年的《中國心血管病報告》顯示，中國心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）的患病率和病死率仍處在上升階段，CVD死亡占居民死亡構(gòu)成的40%以上，現(xiàn)患人數(shù)約2.9億，心血管疾病的治療仍面臨嚴峻挑戰(zhàn)，成為當今社會的重大公共衛(wèi)生問題。心血管疾病所造成的心肌損傷表現(xiàn)出具有正常收縮功能的心肌細胞數(shù)量的相對或絕對減少，受損的心肌細胞通過纖維組織瘢痕修復，未受損的心肌細胞出現(xiàn)代償性肥大，造成心肌收縮功能下降，最終導致心力衰竭。在這過程中心肌細胞的再生能力受限成為制約心血管疾病治療的瓶頸，利用干細胞修復衰竭的心肌細胞為突破這一瓶頸帶來希望。

干細胞根據(jù)其不同的來源與分化能力，可分為成體干細胞與胚胎干細胞，其最顯著的特征是具有無限增殖和分化為多種細胞類型的潛能，但胚胎干細胞主要來源自早期發(fā)育的胚胎，在使用過程中受到倫理學限制，此外，在臨床實踐中，患者在應用由干細胞分化的細胞或組織后，需要終身服用免疫抑制劑以對抗自身排斥反應。誘導多潛能干細胞的出現(xiàn)打破了干細胞應用的中的局限，誘導多潛能干細胞簡稱iPSC，是人體的體細胞經(jīng)過重編程后獲得的具有自我更新和多能分化能力等類似胚胎干細胞的生物特性的一種細胞。2006年，日本Yamanaka團隊首次通過4個轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Sox2、c-Myc與Klf4轉(zhuǎn)染到小鼠的成纖維細胞中，成功的獲得了類似胚胎干細胞的多潛能干細胞，從而建立了小鼠誘導多能干細胞系[1]。2007年，Takahashi等通過對人皮膚成纖維細胞進行重編程，獲得人源誘導多潛能干細胞（human induced pluripotent stem cells，hiPSC）[2]。《Science》雜志將該項研究成果列為2008年世界十大科技突破的第二位。誘導多能干細胞不僅避免了在倫理、道德、宗教、以及免疫排斥等方面的諸多問題，此外還克服了既往對疾病研究中由于機制復雜及相關(guān)細胞組織難以獲得而使研究舉步維艱的困難。目前的研究顯示，iPSCs在心肌損傷的修復，心血管相關(guān)的模型的構(gòu)建以及藥物心血管系統(tǒng)藥物安全性評價等方面展現(xiàn)出特有的優(yōu)勢和應用前景，本文將從這三個方面展開介紹。

1.人源誘導多潛能干細胞分化心肌細胞

Kehat團隊[3]最初報道，通過擬胚體和使用含有血清的培養(yǎng)基分化出心肌細胞，但其分化效率僅為5%～10%。之后的研究就分化效率的提高進行深入探索，Mummery等[4]報道了成功通過與小鼠內(nèi)胚層樣細胞（END2）共培養(yǎng)以增強分化效率。使用細胞因子如激活素A（activin A）和BMP4（bone morphogenetic protein 4）在基于胚狀體的分化中實現(xiàn)了更高效的誘導心肌細胞[5-6]。2009年，Zwi團隊[7]成功的將hiPSC分化出可跳動的、具有正常細胞形態(tài)及電生理特性的心肌細胞。隨后多種成分及功能明確的化學小分子誘導分化的方法漸趨成熟。2014年，研究通過調(diào)控經(jīng)典的Wnt信號通路的“CDM3”分化體系，在不使用血清的情況下，成功的將hiPSC分化心肌細胞，且心肌細胞的純度為90%～95%[8]。而通過去除培養(yǎng)基中的谷氨酸與葡萄糖成功分化出純度超過99%的心肌細胞[9]。

從iPSCs分化出心肌細胞，可以自主收縮，隨著心肌細胞的發(fā)育成熟具備良好的肌節(jié)結(jié)構(gòu)及心肌特異性的動作電位和鈣瞬變并表達肌漿網(wǎng)蛋白和離子通道的特點。此外，研究人員使用多種方法，如延長培養(yǎng)時間、電刺激、機械刺激、流體力學以及改良培養(yǎng)基等，促進iPSCs來源的心肌細胞成熟。2018年，哥倫比亞大學的Kacey團隊開發(fā)出一種全新的方法，在僅持續(xù)4周的生物反應器培養(yǎng)下利用血液衍生的iPSCs培育出類似成年的人心肌組織。他們將通常需要9個月的發(fā)育時間壓縮到比其他研究更快更完整的經(jīng)歷心臟成熟，分化成熟的心肌細胞胞核增多、肌節(jié)成熟，T管形成，心肌收縮的頻率、幅度、能量代謝的轉(zhuǎn)變及鈣處理等均與成人的心肌細胞高度一致[10]。這些方法均為iPSCs分化的心肌細胞的應用提供質(zhì)量保證。

2.人源誘導多潛能干細胞分化的心肌細胞對心肌損傷的修復

自2006年，發(fā)現(xiàn)iPSCs以來，其在包括各種心血管疾病在內(nèi)的多種疾病的潛在治療應用價值受到廣泛關(guān)注。2014年，對患有年齡相關(guān)性黃斑變性的患者進行了世界上第一個自體iPSCs衍生細胞的移植，在移植后的第一年，在沒有應用免疫抑制劑的情況下，沒有出現(xiàn)畸胎瘤形成或移植的iPSCs衍生的視網(wǎng)膜上皮（RPE）細胞的免疫排斥跡象[11]。這無疑鼓舞著iPSCs的臨床應用。誘導多潛能干細胞對心肌損傷的修復主要表現(xiàn)在其對心肌梗死或心肌缺血后心肌損傷的修復，預期移植干細胞分化的心肌細胞通過對心肌細胞的收縮功能和營養(yǎng)作用改善心臟功能。對于前一個目的，移植細胞和宿主心肌的電生理整合非常重要。而營養(yǎng)效應主要歸因于移植細胞分泌因子，如生長因子。Shiba等[12]通過豚鼠模型實驗發(fā)現(xiàn)，移植胚胎干細胞源的心肌細胞能夠與周圍宿主心肌形成間隙鏈接，并實現(xiàn)1∶1宿主偶聯(lián)。Chong團隊[13]通過將10億個人胚胎干細胞來源的心肌細胞注射入心肌缺血的靈長類動物獼猴的心肌內(nèi)，觀察2～7周后發(fā)現(xiàn)，外源性的心肌細胞能移植入心肌內(nèi)，并實現(xiàn)肌化與肌電同步。使用人胚胎干細胞衍生的心肌細胞能夠在免疫抑制劑治療后的心梗動物模型的心臟中成功移植。

Kawamura等[14]報道使用豬心肌梗塞模型移植由來自人類iPSCs分化的心肌細胞，可以顯著改善急性心肌梗死清晰度動物模型的心臟功能。Lei等[15]通過將200萬個計量的人源誘導多潛能干細胞分化的心肌細胞、內(nèi)皮細胞與平滑肌細胞注入到心肌損傷模型豬的心臟，發(fā)現(xiàn)iPSCs源的細胞不僅可以植入到模型豬的心臟中，并且能在維持心率正常的情況先下，顯著改善心肌損傷造成的心肌凋亡，改善左心室功能及心肌代謝功能等。2015年，Menasche團隊[16]首次報道了成功運用人胚胎干細胞來源的心肌祖細胞移植到晚期缺血性心力衰竭患者的心臟中。綜上，考慮到來源iPSCs的心肌細胞的顯著優(yōu)勢，其臨床應用前景廣闊。

3.人源誘導多潛能干細胞分化的心肌細胞在心血管疾病模型中的應用

人與小鼠的心肌細胞電生理特性存在顯著差異，小鼠的心肌細胞具有較短的動作電位時程和較快的心率（≈600次/min），這些差異是小鼠模型無法充分再現(xiàn)人類心血管疾病的重要原因，而人原代的心肌細胞又難以在體外穩(wěn)定的取樣和保持，而來自患者體細胞誘導的iPSCs分化的心肌細胞，具備人體整套的遺傳背景，能夠建立患者特異性的疾病模型，較動物細胞相比，可以更好的應用于人類疾病的研究。

基于iPSCs的疾病模型的最早報道之一是長QT綜合征（long QT syndrome，LQT），長QT綜合征是由復極相關(guān)的離子通道基因突變引起，患者心電圖表現(xiàn)出QT間期延長，增加致命性室性心律失常的風險。目前發(fā)現(xiàn)的遺傳性LQT有13種亞型，已經(jīng)報道的基于iPSCs的長QT綜合征疾病亞型的模型有LQTS1[17-19]，LQTS2[20-23]和LQTS3[24-25]，首先被報道的是LQTS1，該亞型是由KCNQ1（KCNQ1-190Q）突變引起的，KCNQ1（KCNQ1-190Q）為編碼慢速延遲整流外向鉀通道IKsa亞單位的基因，從KCNQ1突變患者源的IPSCs分化的心室肌細胞電生理檢測顯示出延長的動作電位時程，IKs電流降低，使用IKs阻滯劑后未見改善，進一步證實了其IKs通道異常[17]。此外，有關(guān)LQTS2亞型的文章報道，由于2型長QT綜合征是由（KCNH2-A614V突變引起的，KCNH2參與編碼快速激活延遲整流鉀通道IKr的α亞單位基因，運用伴有KCNH2突變的iPSCs分化的心肌細胞，其電生理檢測顯示動作電位時程延長，IKr電流降低，對突變的基因進行基因敲減可以糾正電生理異常[23]。此外，由SCN5A負責編碼鈉內(nèi)流通道亞單位的基因突變造成的鈉通道異常是LQT3的主要病因，2013年，Terrenoire和Ma團隊，分別成功的使用患者特異性的iPSCs構(gòu)建了LQTS3疾病模型[24-25]。另外基于iPSCs疾病模型研究還包括Timothy綜合征[26]，該疾病是由負責編碼CaV1.2的L型鈣通道的基因CACNA1C突變引起，該病患表現(xiàn)出QT間期延長，自閉癥和免疫缺陷等一系列病癥，使用帶有CACNA1C突變的IPSCs分化的心室肌細胞的電生理檢測結(jié)果顯示動作電位持續(xù)時間延長和頻繁的延遲后去極化，L-型鈣通道失活受損，導致該通道功能亢進，使用促進CaV1.2失活的化合物roscovitine后能顯著縮短心室肌細胞的動作電位持續(xù)時間。

此外，患者特異性的iPSCs也被用于體外構(gòu)建心肌病疾病模型，最早的報道之一是有關(guān)LEOPARD綜合征的研究[27]，該疾病的主要的臨床表現(xiàn)包括肥厚型心肌病、肺動脈瓣狹窄、生長遲緩及耳聾等，LEOPARD綜合征是由PTPN11基因突變引起的，該基因是一種蛋白酪氨酸磷酸酶，在RAS/MAPK信號通路上發(fā)揮重要作用，患者源的IPSCs分化的心肌細胞表現(xiàn)出細胞形態(tài)增大和NFATC4的核異位，這些與肥厚性心肌病的細胞變化一致，另外，心肌細胞還表現(xiàn)出ERK和MEK的磷酸化上調(diào)。而基于擴張性心肌病患者iPSCs分化的心肌細胞，表現(xiàn)出肌小節(jié)紊亂、收縮功能下降及鈣通道異常等一系列與擴張型心肌病一致的細胞特征，運用美托洛爾可以改善擴張型心肌病患者iPSCs分化的心肌細胞在TNNT2點突變的疾病表型[28-31]。致心率失常性右心室心肌病是另一種以患者iPSCs構(gòu)建的心肌病疾病模型，伴有PKP2點突變的患者成纖維細胞源iPSCs分化的心肌細胞在正常的培養(yǎng)條件下未表現(xiàn)出病理學表型，但當培養(yǎng)基中補充了限定因子誘導脂肪生成途徑激活后，心肌細胞不僅表現(xiàn)出脂肪生成的增加還表現(xiàn)出心肌細胞的凋亡，該研究也表明誘導成人體內(nèi)新陳代謝條件可以促進體外細胞模型的疾病表型的表現(xiàn)[32]。

其他類型的基于患者源的iPSCs構(gòu)建的心血管疾病模型還包括Barth綜合征，Barth綜合征是由TAZ基因突變導致的，該突變在線粒體結(jié)構(gòu)中起重要作用，突變的TAZ引起線粒體結(jié)構(gòu)和功能的異常，研究證實源自Barth綜合征患者iPSCs衍生的心肌細胞顯示線粒體功能障礙，收縮功能異常及活性氧增高，加入線粒體靶向的抗氧化劑mito TEMPO可以糾正Barth綜合征患者iPSC源的心肌細胞異常[33]。

綜上所述，現(xiàn)代研究不僅證明使用患者源的iPSCs分化的心肌細胞構(gòu)建疾病模型的可行性，還為治療基因突變導致的心血管疾病的治療提供了新的見解。

4.人源誘導多潛能干細胞分化的心肌細胞在心血管疾病藥物安全性評價中的應用

基于安全性考慮，約30%的潛在候選藥物在臨床開發(fā)階段中止，其中大部分是因為心血管不良反應而排除在外，近年新上市藥物如Avandia、馬來酸羅格列酮等，因為患者服用后產(chǎn)生了嚴重的心臟毒副作用，而被緊急撤回[34]。可見，藥物的心臟毒性是制約藥物研發(fā)的難題，也是藥物臨床前安全評價研究的重要問題。由于藥物引起的心臟毒性的實際風險是由多個心臟通路調(diào)控的，因此如目前采用的穩(wěn)定表達hERG的細胞系（即KCNH2，編碼IKr通路）來鑒定具有阻斷IKr電流傾向的化合物安全性評價可能不足以描述實際的風險。缺乏特異性也可能導致高估藥物的實際心臟毒性，終止?jié)撛谟行У男滤幯邪l(fā)。iPSCs源的心肌細胞有助于解決這些局限，大多數(shù)在成人心肌細胞中出現(xiàn)的電流可以在iPSCs分化的心肌細胞中重現(xiàn)。2011年，Gou等[35]報道運用單層搏動的iPSC-CM建立體外高通量篩選模型，精確的對藥物引起的心臟功能異常進行了精確的檢測，即通過帶有微電極陣列的96孔板，檢測iPSC-CM同步收縮的頻率、節(jié)律以及幅度，通過該篩選模型評價了28種已知具有心臟毒性的化合物，研究結(jié)果證實該模型能夠靈敏、精確的檢測出該化合物的特異性心率改變及振幅改變。iPSC-CM模型的建立開拓了藥物體外心臟毒性檢測的新領(lǐng)域，該模型能夠更加全面、特異性地檢測藥物的心臟毒性。近年來，多潛能干細胞分化的心肌細胞在心臟毒性篩選中的應用越來越廣泛。Eldrige等[36]通過運用ErbB信號通路的抑制劑和激活劑處理的hiPSC來源的心肌細胞，能夠緩解或加重多柔比星誘導的心肌損傷。2016年，Paul[37]團隊運用接受阿霉素治療的乳腺癌患者的iPSCs分化的心肌細胞，分別從心肌細胞的結(jié)構(gòu)、心肌細胞的收縮功能、線粒體膜電位、氧化應激等方面全面系統(tǒng)的評價阿霉素的心臟毒性。為阿霉素心臟毒性的藥理機制提供了堅實的實驗證據(jù)。iPSCs分化的心肌細胞相當于胚胎心肌細胞，針對藥物的安全性測試，心肌細胞需要顯示出于成人心肌一致的藥物反應，因此研究人員不斷提高心肌細胞的成熟程度以提高iPSCs源的心肌細胞對藥物心臟毒性預測水平，隨著iPSCs分化成熟心肌細胞的技術(shù)不斷完善，其將在心血管藥物的研發(fā)、篩選及早期毒性評價發(fā)揮重要作用[38]。

5.挑戰(zhàn)與展望

綜上所述，近年來，hiPSCs源分化的心肌細胞廣泛運用于心血管疾病模型的制備、疾病機制研究、疾病治療以及藥物篩選等方面。但hiPSC源的心肌細胞的應用仍面臨許多問題：首先，就其在損傷心肌的修復作用的研究中發(fā)現(xiàn)未轉(zhuǎn)化的干細胞對機體存在損害，容易產(chǎn)生免疫排斥，研究發(fā)現(xiàn)來源自某種遺傳背景的ES細胞當移入遺傳背景相同的實驗動物后，會產(chǎn)生畸胎瘤，即出現(xiàn)免疫耐受。此外，干細胞作為一種外源性的物質(zhì)移植入心臟是否能引起致命性的心率失常尚存有爭議，目前發(fā)現(xiàn)iPSC移植可發(fā)生室性早搏，但發(fā)生率并不顯著，目前主要考慮可能與移植IPSC后分布密度不均及注射過程中的不良刺激有關(guān)。此外，hiPSC疾病模型的制備及藥物篩選中的運用也存在一定的局限，盡管iPSCs衍生的心肌細胞能更真實的模擬機體的心肌細胞功能，但針對涉及多種細胞類型且機制復雜的心血管疾病，更需要構(gòu)建組織或者器官水平的疾病模型，雖然通過hiPSC可以分化出上皮細胞以及平滑肌細胞，但模擬心臟組織還很難實現(xiàn)。最后，目前hiPSC獲得的心肌細胞主要為心室肌細胞，只包含較少的心房肌細胞與竇房結(jié)細胞，對分化出高純度亞型特異性的心肌細胞技術(shù)還需進一步研究完善。希望隨著基因編輯以及組織工程技術(shù)的發(fā)展，hiPSCs分化心肌細胞的研究也不斷深入，早日構(gòu)建出表型成熟和亞型特異的心肌細胞模型，更好的應用在心血管疾病的基礎(chǔ)研究與臨床實踐中。