一起雞傳染性鼻炎的診斷

王麗輝，張永欣

（1.重慶市畜牧科學院，重慶 402460；2.天津瑞普生物技術股份有限公司，天津 300300）

雞傳染性鼻炎是由副雞禽桿菌引起的一種急性上呼吸道傳染病，臨床癥狀主要以感染后腫頭、流鼻涕及鼻竇發炎為特征，引起蛋雞產蛋率下降及育成雞和肉雞生長不良和淘汰率增加，嚴重影響雞只的生產性能[1-4]。副雞禽桿菌的易感日齡主要分為育成階段和產蛋階段，7～18周齡感染后主要引起雞只生長不良，在產蛋階段感染后會導致產蛋率下降30%～50%，給養雞業造成較大的經濟損失，該病由于傳播快，易于造成混合感染，而受到當前規模化、集約化養禽業的普遍重視[5]。根據美國學者Page1962年的分類方法，將副雞禽桿菌分為A、B、C 3個血清型，不同血清型之間免疫關系相距較遠，B型菌的免疫保護具有一定的型特異性[6-7]。

本試驗自重慶某雞場的部分發病雞中，經臨床診斷為雞傳染性鼻炎，對病雞的眶下竇進行細菌培養和PCR診斷，確診為雞傳染性鼻炎。我國于1986年首次在北京分離到副雞禽桿菌，而后陸續在不同省、市、區分離到副雞禽桿菌，經鑒定均為Page A型；Page C型副雞禽桿菌在我國曾有過報道，但分離菌株并沒有保存下來；2003年張培君等從遼寧某雞場分離到1株B型副雞禽桿菌，這是我國首次報道的由Page B型引起的雞傳染性鼻炎[8-12]。雞傳染性鼻炎在我國不同地區均有發生，流行毒株也有地域差異，不同地區報道的疾病的發生，對當地的疾病防控具有重大的意義[13-14]。

1 試驗材料

1.1 病料來源

病雞來源于重慶某雞場，病雞表現為腫頭、眼角有淚痂、流涕，精神不振，不喜食，具有雞傳染性鼻炎的典型癥狀。

1.2 試劑

含輔酶I的雞肉湯瓊脂平板、全血平板、革蘭氏染色液等，均為自制；dNTP、PCR bufer、Taq DNA聚合酶、DNA Marker DL1000、均購自生工生物工程（上海）有限公司；其他試劑，均為分析純。

1.3 PBS

稱 取 NaCl 6.0 g、 Na2HPO41.757 g、NaH2PO40.709 g，溶于1 000 mL水中，溶解后用10%NaOH調pH至6.9～7.1，121℃高壓滅菌15 min，室溫保存，備用。

2 試驗方法

2.1 培養基配制

雞肉湯的制備：取雞胸脯肉泥1份加純化水2份，在2～8℃浸泡過夜，煮沸30 min，除去肉渣，澄清過濾。

雞肉湯培養基的制備：取多聚蛋白胨5 g、酪蛋白氨基酸5 g、氯化鈉5 g和雞肉湯100 mL，加入純化水至1 000 mL，調pH至7.4。經121℃高壓蒸汽滅菌15 min并冷卻至40℃以下，加入終濃度2%滅活的雞血清和10 μg·mL-1NAD用于細菌培養。

雞肉湯瓊脂培養基的制備：稱取多聚蛋白胨1 g、酪蛋白氨基酸1 g和NaCl 1 g，用200 mL雞肉湯溶解后，使用10%氫氧化鈉調pH至7.3～7.4，然后加瓊脂3.6 g使其完全溶解。經121℃高壓滅菌15 min，取出后降溫至約60℃，加入10 mL雞血清和終濃度10 μg·mL-1NAD，混勻后制備培養平板或斜面備用。

2.2 發病情況

2018年，來源于重慶某雞場100～130日齡商品育成雞發生多起以頭部腫脹、流淚為主要臨床癥狀的病例，病初僅有少數雞群發病，幾天后就迅速蔓延至所有雞群，個別雞只出現死亡，嚴重影響雞的生長發育，給雞場帶來巨大的經濟損失。

2.3 細菌的分離培養

將疑似雞傳染性鼻炎癥狀的病雞頭，用無菌手術刀片切開眶下竇，用棉拭子沾取眶下竇內容物，接種于血平板，于37℃培養箱中培養48 h后觀察菌落。若出現疑似的單個菌落，進行純化培養。挑取單個菌落進行革蘭氏染色，在光學顯微鏡下觀察細菌的形態特征；同時在含NAD的雞血清雞肉湯瓊脂平板上劃線，挑取單個可疑菌落接種到含血清的雞肉湯中進行純培養，同時進行下一步的鑒定。

2.4 形態特征

參照中華人民共和國農業行業標準NY/T 538-2002雞傳染性鼻炎診斷技術方法，對可疑病料進行副雞禽桿菌的分離。用棉拭子在無NAD的雞血清雞肉湯瓊脂上劃5～7條橫線，然后再用產NAD表皮葡萄球菌劃一豎線，翻轉平皿置37℃5%CO2培養箱培養18～20 h，觀察疑似菌落是否出現衛星現象，并挑取典型菌落進行過氧化氫酶試驗。

2.5 PCR鑒定

2.5.1 PCR菌落樣品制備

挑取平皿上的可疑菌落，加到含10 μL水的0.2 mL小離心管中，壓緊管蓋，95℃加熱10 min，再冰浴10 min后進行PCR擴增或-20℃保存。

2.5.2 PCR陰陽性對照樣品制備

用10μL水作為陰性對照樣品，用9 μL水加1 μL已知陽性對照物作為陽性對照樣品。95℃10 min，再冰浴10 min后進行PCR擴增或置-20℃保存。

2.5.3 引物設計

參照中華人民共和國農業行業標準NY/T 538-2002雞傳染性鼻炎診斷技術方法根據16srRNA設計鑒定副雞禽桿菌鑒定引物，擴增全長為527 bp。上游為5'-TGAGGGTAGTCTTGCACGCGAAT-3'，下游為5'-CAAGGTATCGATCGTCTCTCTACT-3'。

2.5.4 PCR擴增

參照NY/T 538-2002雞傳染性鼻炎診斷技術方法，將樣品管5 000 r·min-1離心5 min，吸上清做DNA模版，配制25 μL反應體系。再瞬時離心，置PCR儀上進行擴增反應。PCR反應程序為：94℃10 min；94℃30 s，65℃30 s，72℃ 1 min，循環34次，72℃延伸10 min。

2.5.5 瓊脂糖凝膠電泳

待PCR反應結束后，每個PCR樣品取5 μL于含0.5 μg·mL-1EB的2.0%瓊脂糖凝膠孔中電泳，同時加入5 μL的1 000 bp的Mark作為參照，在120 V恒壓電泳中20 min，取凝膠置紫外成像儀觀察。

2.5.6 結果判定與表示方法

陽性對照樣品應在500 bp附近呈現一條目的條帶，陰性對照樣品無條帶。被檢樣品若出現與陽性對照同樣大小的一條目的條帶，則判為陽性，記作“+”，若無條帶，則判為陰性，記為“-”。

2.6 動物回歸實驗

挑取將可疑菌落，接種到含血清的雞肉湯中進行純培養，搖床160 r·min-1，培養18 h，取新鮮的雞肉湯培養物0.5 mL，眶下竇接種30日齡SPF雞5只，接種后逐日進行10日臨床觀察，并記錄結果。

3 試驗結果

3.1 發病情況

病雞主要表現為眼瞼腫脹、鼻道和鼻竇有粘液性分泌物流出等上呼吸道癥狀。發病初病雞精神沉郁，垂頭縮頸，鼻孔流出稀薄水樣鼻液，3～5 d后轉變為黏液性分泌物。眼結膜發炎，流淚，一側或兩側眼眶周圍組織水腫，發病后，雞群采食量明顯下降。

3.2 細菌分離情況

病雞眶下竇內分泌物在雞血清雞肉湯瓊脂平板上為露滴狀菌落，在普通肉湯和普通瓊脂平板上不生長，挑取菌落圖片，革蘭氏染色鏡檢可見為兩級濃染的陰性短桿狀，在輔酶Ⅰ的肉湯瓊脂上和全血平板上生長灰白色、邊緣整齊、表面光滑、有輕度隆起、黏液狀、濕潤、有光澤、不透明的菌落。

3.3 衛星現象

分離物在接種有表皮葡萄球菌的雞血清雞肉湯瓊脂平板上呈現出明顯的“衛星現象”，即越靠近葡萄球菌的周圍其生長越好，且過氧化氫酶陰性，初步判定為疑似副雞禽桿菌疑似菌落。

3.4 PCR鑒定

根據上述生化鑒定結果，用針對副雞禽桿菌16sRNA設計的引物，對該菌進行PCR鑒定，可得到大小為0.5 kb的片段，與陽性樣品一致，而陰性樣品中無該片段的條帶。通過PCR方法檢測，驗證其為副雞禽桿菌，結果見附圖。

3.5 動物回歸實驗

取可疑菌落制備成菌懸液，取0.2 mL接種30日齡SPF雞眶下竇，接種雞在8 h后即可見到流鼻涕，腫頭等典型的鼻炎癥狀，臨床觀察記錄結果見附表。接種48 h后，所有雞均開始出現典型的鼻炎癥狀即攻毒一側眶下竇及周圍腫脹，鼻部有鼻涕或結痂，在攻毒第3～5天最為嚴重，隨后不再有新發病例出現，在9 d后所有病例逐漸好轉。

附圖 PCR鑒定結果

附表 SPF雞攻毒結果

4 治療和預防

4.1 治療

對發病雞只進行隔離治療，使用消毒劑進行帶雞消毒，連續消毒5 d，土霉素按使用說明書2～3倍量飲水治療。未發病的雞群，緊急接種雞傳染性鼻炎疫苗。

4.2 預防

4.2.1 疫苗接種

科學的預防接種免疫，是防治本病的關鍵措施，可根據近年來雞場附近的流行毒株選用適用的疫苗，進行科學的免疫程序。雞傳染性鼻炎有A、B、C 3個血清型，不同血清型之間的無交叉免疫保護，因此在免疫時應考慮使用A、B、C型三價疫苗來進行免疫，通常在4～6周齡免疫1次，間隔10周，進行第2次免疫。

4.2.2 科學的飼養管理

加強飼養管理，提高飼養條件，有通風保障，調控飼養密度適應飼養周期；一旦發病，立即隔離治療發病雞，對未發病雞進行帶雞消毒；對曾發本病的雞舍，進雛前應進行徹底的清洗和消毒，并應空舍1～2周，再重新進雞；本病易與大腸桿菌等病混合感染可引起病雞死亡，病程較長，反復發生，難以凈化，應采用全進全出的雞群飼養管理辦法，可有效地減少本病的發生；不同的飼養周期選用合理的飼料配方，增加礦物元素和維生素，提高雞群的免疫力；對進出場區的人員、車輛、物品進行消毒后，才能準入，嚴禁人員串舍，切斷病毒傳播幾率。

5 小 結

該雞場由于在產蛋前未接種過雞傳染性鼻炎疫苗，產蛋后由于溫度變化，導致雞群應激，引起呼吸道癥狀，進而伴隨其他呼吸道疾病的繼發感染，使疫情變得復雜。可依據臨床表現和剖檢進行初步診斷，進一步需用RT-PCR進行診斷，該飼養場在發現病情確診后，緊急進行雞傳染性鼻炎疫苗的預防接種，在短時間內緩解了病情。對雞傳染性鼻炎的防治要進行科學的疫苗接種和飼養管理，才能提高養殖的經濟效益。