肺炎克雷伯氏菌漆酶基因的克隆及其在畢赤酵母中的高效表達

王建玲，桂 爽，付 禹，張妤彤，鄭 東，路福平，劉逸寒

(工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業微生物重點實驗室，工業酶國家工程實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

漆酶(laccase，EC 1.10.3.2)，又稱漆酚氧化酶、多銅氧化酶，是一種含銅的多酚氧化酶，屬于銅藍氧化酶蛋白家族的一員[1–2]．漆酶的作用底物較為廣泛，能夠催化包括多酚類、二胺、芳胺類、羧酸類在內的250多種有機物發生氧化、聚合等反應．由于漆酶具有特殊的催化性能和寬泛的作用底物，因此其應用較為廣泛，包括紡織業中的染料脫色、造紙工業中的生物漂白、食品行業中食品風味改良、檢測酚類污染物生物傳感器的構建和生物電子研發等[3–6]．部分上述工業過程需要在高溫、強酸、強堿等惡劣條件下進行，因此，需要漆酶具有較好的溫度和pH穩定性[7]．

漆酶主要存在于植物、真菌、少數昆蟲和細菌中，其中真菌漆酶來源最為廣泛，研究較為深入的真菌漆酶主要來自白腐真菌(C.thermophilium)[8]、射脈菌(Phlebia radiata)[9]、云芝栓孔菌(Trametes versicolor)[10]、鮮紅密孔菌(Pycnoporus cinnabarinus)[11]、糙皮側耳(P.ostreatus)[12]、毛木耳(Auricularia polytricha)[13]和黑木耳(Auricularia auricula)[14]等．目前，關于真菌漆酶的研究眾多，但其存在堿性條件下活性較低、熱穩定性較差和絲狀真菌生長周期長等缺點．細菌漆酶來源較少，目前已在生脂固氮螺菌(Azospirillum lipoferum)[15]、鏈霉菌(Streptomycetes)[16]、球形芽胞桿菌(Bacillus sphaericus)[17]、枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)[18]、嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)[19]及肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)[20]等細菌中發現過漆酶活性．與真菌來源漆酶相比，細菌漆酶在堿性條件下具有較好的催化活性和穩定性及存在 Cu2+抗性等優點[21–23]．以 2，6-DMP 為底物時，細菌漆酶的最適溫度一般在 60～65℃，最適 pH 一般為 7.0～8.0，在 25～60℃和 pH 6.0～9.0范圍內穩定性較好[24–27]．另外，黃俊等[20]篩選獲得一株產漆酶菌 Klebsiella sp.601，以 2，6-DMP為底物時，該漆酶在 pH 5.0～8.0條件下較穩定，在 pH 3.0～4.0、pH 9.0～10.0條件下，幾乎沒有殘余酶活力．本實驗室前期從中國西雙版納土壤中篩選獲得一株含漆酶基因(lac)的肺炎克雷伯氏菌[28]，lac基因與上述Klebsiella sp.601來源漆酶基因相比，共有18個不同氨基酸，該漆酶以2，6-DMP 為底物時，在pH 5.0～9.0條件下較穩定，在 pH 3.0～4.0、pH 10.0～11.0條件下，其殘余酶活力在 20%以上，在 30～70℃條件下較穩定，其殘余酶活力在40%以上，表明該漆酶具有良好的 pH和溫度穩定性，但由于是在大腸桿菌中表達，難以實現高效合成．

本研究旨在通過構建前期篩選獲得的具有良好酶學特性的 lac畢赤酵母重組菌株，實現該重組漆酶的高效分泌表達，為其應用奠定基礎．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質粒

肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)TCCC111142、質粒 pUC57-lacm(根據畢赤酵母的密碼子偏愛性優化的漆酶基因lacm克隆入pUC57中，由北京六合華大基因科技有限公司合成)、大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α、畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115、質粒pPIC9K均為本實驗室保存．

1.1.2 主要試劑與工具酶

Taq DNA 聚合酶、限制性內切酶 EcoRⅠ、NotⅠ，Takara公司；質粒快速提取試劑盒和 DNA 純化回收試劑盒，Omega公司；蛋白胨和酵母浸粉，Oxoid公司；其他試劑均為國產分析純．

1.1.3 培養基

LB固體培養基(g/L)：酵母提取物5.0，胰蛋白胨10.0，NaCl 10.0，瓊脂 15．

YPD 固體培養基(g/L)：酵母提取物 10，蛋白胨20，葡萄糖 20，瓊脂 20．

BMGY 液體培養基(g/L)：酵母提取物 10，蛋白胨 20，YNB 13.4，甘油 5，生物素 0.04；1mol/L 磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)100mL．

BMMY 液體培養基(g/L)：酵母提取物 10，蛋白胨20，YNB 13.4，加入生物素0.04；1mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)100mL，每日補加甲醇5mL．

MD 培養基(g/L)：葡萄糖 20，瓊脂 15，YNB 13.4，生物素 0.04．

1.2 方法

1.2.1 肺炎克雷伯氏菌漆酶基因擴增

通過NCBI基因庫查找，根據已報道的肺炎克雷伯氏菌漆酶成熟肽基因，分析其保守序列，設計TCCC111142成熟肽編碼基因的擴增引物，上游引物A-3′(下劃線部分為加入的 EcoRⅠ酶切位點)，下游劃線部分為加入的 NotⅠ酶切位點，雙下劃線部分為添加的6個組氨酸標簽，方便純化蛋白)．

以肺炎克雷伯氏菌基因組為模板，以 P1和 P2為引物，進行 PCR擴增．擴增條件為：95℃預變性10min；95℃變性 30s，55℃退火 45s，72℃延伸1min 40s，30個循環；72℃延伸 10min．

將 PCR擴增產物進行測序后，獲得 lac基因序列，根據畢赤酵母的密碼子偏愛性優化該基因，由北京六合華大基因科技有限公司進行合成，得到新型漆酶基因lacm．

1.2.2 重組質粒的構建

重組質粒pUC57-lacm和質粒pPIC9K經EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切并純化回收后，用T4 DNA連接酶連接，轉化大腸桿菌 DH5α感受態細胞中，經氨芐青霉素(Amp)抗性篩選，挑選陽性轉化子；提取質粒，并進行酶切驗證．

1.2.3 電轉化畢赤酵母

提取重組菌質粒 pPIC9K-lacm，用 SacⅠ酶切線性化并進行純化回收；制備畢赤酵母 GS115的感受態細胞；然后采用電轉化法將線性化的重組質粒pPIC9K-lacm轉化到畢赤酵母GS115，將電轉液涂布于MD平板，30℃靜置培養至轉化子出現．

1.2.4 酵母轉化子PCR鑒定

從 MD平板上挑選轉化子提取基因組，以其基因組為模板，用上述lacm基因特異引物進行PCR反應，凝膠電泳檢測 lacm基因是否插入到畢赤酵母GS115的染色體上．

1.2.5 漆酶在畢赤酵母中的誘導表達

選擇 PCR鑒定為陽性的菌落 GS115/pPIC9K-lacm和轉有空質粒的對照菌株 GS115/pPIC9K接種至 YPD 液體培養基中，30℃、220r/min培養 24h.以 3%的接種量轉接到新鮮 BMGY培養基中，繼續以 30℃、220r/min培養 24h，然后以 6000r/min離心 10min收集菌體，將菌體轉接到 BMMY培養基中．再以 30℃、220r/min培養，并每隔 12h補加一次甲醇，使其終體積分數保持在0.5%，培養120h后可得到重組漆酶(rLACM)的粗酶液．

1.2.6 純化rLACM

采用鎳柱純化親和層析法純化 rLACM，步驟如下：將含有 Ni樹脂裝入合適的純化柱中，樹脂體積為 2mL；用預冷的 Lysis Buffer緩沖溶液平衡樹脂2～5個床體積；將平衡后的樹脂與經過膜(0.22μm)過濾的粗酶液混合，在4℃條件下通過磁力攪拌器使二者結合 40～60min；將樹脂與粗酶液的結合液過柱；加入預冷的 Wash Buffer緩沖溶液 20mL，進行清洗雜蛋白；用500mmol/L咪唑的Elution Buffer緩沖溶液5mL進行洗脫，用于SDS-PAGE檢測目標蛋白的相對分子質量和純度．

1.2.7 表達產物的SDS-PAGE分析

重組菌株 GS115/pPIC9K-lacm 和對照菌GS115/pPIC9K 在30℃誘導培養結束后，取1mL發酵液離心去除菌體，取上清液和純化后 rLACM 各40μL進行SDS-PAGE分析．

1.2.8 漆酶活力測定及酶學性質考察

取 200μL的含 4mmol/L Cu2+的 0.1mol/L的檸檬酸–磷酸氫二鈉緩沖液(pH 2～8)或者含 4mmol/L Cu2+的 0.05mol/L的甘氨酸–氫氧化鈉緩沖液(pH 8.5～11)，于96孔板中，70℃保溫1min．加入10μL的稀釋適當倍數的純酶液，混勻，70℃保溫1min．再加入30μL的底物(8mmol/L的2，6-DMP)，混勻，記錄反應初始吸光度和反應3min時吸光度．在一定的條件下，每分鐘氧化1μmol的2，6-DMP所需要的酶量定義為一個酶活力單位(U)．

用pH 8.0的磷酸緩沖溶液配制漆酶的2，6-DMP底物，分別在20～100℃測定其酶活力，確定rLACM的最適溫度．將酶液置于 pH 8.0緩沖液，在 30～80℃溫浴，每隔 1h取樣，在最適反應條件下測定其酶活力，考察其溫度穩定性．

分別用pH為2.0～11.0的磷酸緩沖溶液配制漆酶底物 2，6-DMP，在 70℃反應下，確定 rLACM 的最適pH．將酶液置于pH 3.0～10.0緩沖液，于70℃保溫35h，每隔5h測定rLACM酶活力，考察其pH穩定性．

2 結果與分析

2.1 重組質粒pPIC9K-lacm的構建

以肺炎克雷伯氏細菌的基因組為模板，以引物P1和P2擴增目的基因lac．在lac基因序列基礎上，基于畢赤酵母密碼子偏愛性，優化合成獲得 lacm基因，與 lac相比，共改變 406個堿基，GC含量由61.3%變為 48.4%．重組質粒 pUC57-lacm與質粒pPIC9K均經 EcoRⅠ和 NotⅠ雙酶切后連接，轉化大腸桿菌 DH5α感受態細胞中，經 Amp抗性篩選，挑選陽性轉化子，提取質粒并進行酶切驗證．如圖 1所示，經過 EcoRⅠ和 NotⅠ雙切，重組質粒產生約1600bp和 9300bp的兩條帶，與預計大小相符，證明重組質粒構建成功．

圖1 重組質粒的酶切鑒定Fig. 1 Enzyme digestion idenfication of recombinant plasmid

2.2 重組質粒電轉及轉化子鑒定

將重組質粒 pPIC9K-lacm線性化后電轉畢赤酵母GS115感受態，將電轉液涂布于MD平板．從MD平板上挑選轉化子，提取基因組，進行 PCR驗證．如圖2所示，得到一條約1600bp的條帶，證明lacm插入到畢赤酵母染色體中，成功構建重組菌株GS115/pPIC9K-lacm．

圖2 GS115/pPIC9K-lacm的PCR擴增結果Fig. 2 PCR amplification results of GS115/pPIC9K-lacm

2.3 rLACM的誘導表達及純化

對照菌株 GS115/pPIC9K和重組菌 GS115/pPIC9K-lacm經甲醇誘導發酵 120h后，離心得到發酵上清液．以2，6-DMP為漆酶底物時，測得rLACM的酶活力達到 0.37U/mL，而嗜熱棲熱菌來源的熱穩定性好的漆酶酶活力約為 0.022U/mL，嗜鹽菌Chromohalobacter salexigens來源的漆酶活力達到0.14U/mL[25,29]．

對 rLACM 進行 SDS-PAGE分析，如圖 3(a)所示，GS115/pPIC9K-lacm 與 GS115/pPIC9K 相比，在相對分子質量 5.8×104左右多出一條帶，與預期rLACM 大小一致，以上說明 GS115/pPIC9K-lacm成功高效分泌表達rLACM．

如圖 3(b)所示，使用鎳柱親和層析法純化rLACM，并進行 SDS-PAGE分析，有一條單一條帶，其相對分子質量約為 5.8×104，可用于后續的酶學性質研究．

圖3 rLACM的SDS-PAGE分析Fig. 3 SDS-PAGE analysis of the rLACM

2.4 rLACM的酶學性質

2.4.1 rLACM的最適溫度和溫度穩定性

rLACM 的最適溫度和溫度穩定性如圖 4所示．rLACM 的最適反應溫度為 70℃，在 30～90℃范圍內具有酶活性．對 rLACM 的熱穩定性進行分析，其在30℃和40℃條件下保溫5h，酶活力可維持在 95%左右；在 50℃和 60℃條件下保溫 5h，酶活力仍在 50%以上；在 80℃條件下保溫 1h，殘余活力為25%左右．

圖4 rLACM的最適溫度和溫度穩定性Fig. 4 Optimum temperature and thermostability for rLACM

由此可見，rLACM 的熱穩定性能比真菌中的米曲霉(Aspergillus oryzae)以及細菌中的嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)的漆酶熱穩定性能更加穩定[30-31]．另外，黃俊等[20]報道的肺炎克雷伯氏菌 601(Klebsiella sp.601)來源漆酶在 80℃處理 30min，則完全失活；而 rLACM 在 80℃條件下保溫 1h，殘余活力為 25%左右．這表明 rLACM 具有較好的熱穩定性．

2.4.2 rLACM的最適pH和pH穩定性

rLACM的最適 pH和 pH穩定性如圖 5所示．rLACM的最適pH為8.0，在pH 7.0～9.0的范圍內具有酶活性．對 rLACM 的 pH穩定性進行分析，其在pH 7.0和pH 8.0的條件下保溫35h，其殘余活力在70%以上．在pH 5.0和pH 6.0以及pH 8.0和pH 9.0的條件下保溫20h，其殘余活力在60%以上，而黃俊等[20]報道 Klebsiella sp.601來源漆酶在 pH 8.0和 pH 9.0條件下保溫 24h殘余酶活力分別為55%和10%左右．此外，在pH 4.0、pH 10.0的條件下保溫20h，其殘余活力仍分別保持在41%和35%．該結果表明，rLACM具有較寬的pH穩定范圍．

圖5 rLACM的最適pH和pH穩定性Fig. 5 Optimum pH and pH stability for rLACM

由上述研究表明，rLACM 與目前報道的細菌來源漆酶相比，兼具較好的熱穩定性及較寬的 pH穩定范圍；同時，經在畢赤酵母中表達 lacm基因獲得的rLACM，其酶學性質與在大腸桿菌中表達的重組漆酶[24]相似，說明表達宿主的改變并未影響漆酶的特性，從而可以通過畢赤酵母表達系統制備該性能優良的rLACM．

3 結 語

本研究以肺炎克雷伯氏菌的基因組為模板，通過PCR擴增得到其漆酶基因 lac，基于畢赤酵母密碼子偏愛性優化后得到新型漆酶基因 lacm，并成功構建重組菌株 GS115/pPIC9K-lacm，以 2，6-DMP為底物，發酵液中的酶活力達到 0.37U/mL，實現肺炎克雷伯氏菌漆酶的高效分泌表達．經酶學性質分析表明，以 2，6-DMP為底物時，rLACM 的最適溫度為70℃，最適pH為8；在30～70℃、pH 5.0～9.0活力穩定．該rLACM表現出的良好的酶學特性為漆酶的應用奠定了基礎．