維生素D在卵巢癌中的作用

李賽賽 盛 波 朱雪瓊

卵巢癌是婦科常見的惡性腫瘤之一，由于缺乏有效的早期診斷方法，大多數女性確診時已為晚期，失去了手術時機，其5年生存率只有20%～30%，嚴重威脅婦女的健康[1]。維生素D(vitamin D)是人體必需的一種維生素，1,25二羥維生素D3[1,25-dihydroxyvitamin D3, 1,25(OH)2D3]是體內維生素D的主要活性形式，而25-羥基維生素D(25-hydroxyvitamin D, 25OHD)為1,25(OH)2D3的前體，是目前評估人體內維生素D水平最可靠的指標[2]。研究表明，維生素D在人體內發揮了重要作用，不僅參與調節體內鈣磷代謝，同時與多種腫瘤的發生有著密切的聯系[3]。近年來，維生素D在卵巢癌中的作用引起了越來越多研究者的重視，并取得了一些研究成果。因此，本文就維生素D與卵巢癌的發病風險、在卵巢癌癌變中的表達變化、對卵巢癌細胞生物學行為的影響以及卵巢癌預后的影響等方面的研究進展做一綜述。

一、維生素D與卵巢癌的發病風險

近年來有關維生素D與卵巢癌的研究備受關注，然而關于體內維生素D水平與卵巢癌之間的潛在關系目前仍存在爭議。Arslan等[4]為研究血清25OHD水平與隨后發生侵襲性上皮性卵巢癌的風險之間的關系，采用巢式病例對照研究方法，選取隊列中170例侵襲性上皮性卵巢癌作為病例組，并從隊列中隨機抽取配對的373例健康人作為對照組，采用放射免疫檢測兩組診斷前的血清25OHD水平，從血清樣本收集到腫瘤診斷平均隨訪了5.5年，使用配對Logistic回歸模型分析，控制潛在的混雜因素，研究發現，即使排除了采血5年內確診為卵巢癌的女性，并進行一系列的亞組分析如維生素D受體的遺傳變異、臨床分期、病理分級、組織學類型、體重指數(body mass index, BMI)、絕經情況等來控制可能的混雜因素后，血清25OHD水平與卵巢癌的發病風險沒有相關性。

Tworoger等[5]應用配比的巢式病例對照研究,研究維生素D水平[血漿25OHD及1,25(OH)2D3水平]與卵巢癌發病風險之間的關系。該研究綜合分析了3項前瞻性隊列研究中的827例女性(224例病例和603例對照)，使用放射免疫檢測其維生素D水平，從血清樣本收集到腫瘤診斷平均隨訪了5.5年，使用配對Logistic回歸模型來估計相對危險度(relative risks, RR)和95%置信區間(95% confidence interval, 95% CI)，結果發現血漿25OHD及1,25(OH)2D3水平與卵巢癌的發病風險均沒有相關性；而在體重指數>25kg/m2的婦女中，血漿25OHD水平與卵巢癌的發病風險之間存在著顯著的負相關，且具有充足的25OHD水平(≥32ng/ml)的婦女與25OHD水平不足的婦女比較，其患漿液性卵巢癌的風險略有下降，RR分別為0.39(95%CI:0.16～0.93)和0.64(95% CI:0.39～1.05)。隨后，一項巢式病例對照研究分析了來自7個隊列研究中的516例卵巢癌病例和770例對照，采用化學發光免疫法檢測25OHD水平，從血清樣本收集到腫瘤診斷平均隨訪了5.9年，并進行Logistic回歸模型分析，結果發現血清25OHD濃度與卵巢癌的發病風險無關。研究者為了進一步評估聯系中潛在的異質性，對多種因素進行了分層分析，按照腫瘤亞型、抽血年齡、抽血季節、種族及口服避孕藥進行分層分析，結果仍提示，血清25OHD濃度與卵巢癌發病風險無相關性。然而，按體質指數進行的分層分析結果卻表明，在超重和肥胖(BMI≥25kg/m2)婦女中，體內維生素D水平與卵巢癌發病風險呈負相關[6]。惡性腫瘤風險算法(risk of malignancy algorithm, ROMA)評分可通過結合腫瘤標志物人類附睪蛋白4(human epididymis protein 4,HE4)和糖鏈抗原-125(carbohydrate antigen 125, CA125)來預測發生上皮性卵巢癌的風險。Anastasi等[7]的研究納入了180例肥胖婦女(BMI>30kg/m2)，80例正常體重的婦女(BMI<25kg/m2)，使用全自動免疫分析儀檢測血清25OHD水平，并以20.2ng/ml作為劃分界限值，將其分為25OHD水平充足和25OHD水平不足。研究結果表明，64%的肥胖婦女及11%正常體重的婦女存在血清25OHD水平不足，差異有統計學意義。該學者進一步發現ROMA評分高于13%僅在肥胖女性中檢測到，其中64%的肥胖女性在ROMA評分高于13%的同時伴有血清25OHD水平的不足，只有36%的肥胖女性在ROMA評分高于13%的同時有充足的25OHD水平，差異有統計學意義，提示肥胖婦女中低維生素D水平與高ROMA評分有關。以上研究結果表明，雖然維生素D水平與卵巢癌的總體發病風險沒有相關性，但在超重和肥胖婦女中，低維生素D水平與卵巢癌的發病風險呈正相關。

Toriola等[8]選取芬蘭孕婦隊列為研究對象進行配比的巢式病例對照研究,從血清樣本收集到腫瘤診斷總共隨訪了10年，根據隨后是否發展為卵巢癌，分為病例組(201例)和對照組(398例相同季節對照和199例相反季節對照)，采用放射免疫檢測血清25OHD水平，條件Logistic回歸分析表明，血清25OHD濃度與卵巢癌發病風險之間沒有明顯的相關性；然而，研究者發現與血清25OHD充足的婦女(≥75nmol/L)相比，血清25OHD不足(<75nmol/L)的婦女患卵巢癌的風險增加了3倍，但差異無統計學意義。在2016年，Ong等[9]進行了一項大型孟德爾隨機化研究，其中納入了 31719例歐洲女性(10065例卵巢癌病例及21654例對照)，選取單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)位點rs7944926(DHCR7)，rs12794714(CYP2R1)及rs2282679(GC)作為血清25OHD水平的工具變量進行分析，研究25OHD濃度與卵巢癌之間的關聯性。逆方差加權法結果表明，當25OHD濃度每降低20nmol/L時，用SNP聯合估計所有上皮性卵巢癌亞型(10065例)的發病風險的優勢比為1.27(95%CI：1.06～1.51)，在高級別漿液性卵巢癌(4121例)中的優勢比為1.54(95%CI：1.19～2.01)，提示低25OHD水平與較高卵巢癌發生率相關，且在高級別漿液性卵巢癌的關聯性最明顯。

二、維生素D在卵巢癌癌變中的表達變化

近年來的研究表明，卵巢癌患者的血清25OHD水平顯著低于健康女性及卵巢良性腫瘤患者。Bakhru等[10]選取來自國家健康與營養調查研究的7273例研究對象進行了病例對照研究，采用自動化免疫學方法測定血清25OHD水平。Logistic回歸分析結果表明，卵巢癌患者處于低25OHD水平的概率是對照組的3.68倍。在多變量模型中，當調整了年齡、體重指數和飲食等潛在的混雜因素之后，血清25OHD水平與卵巢癌的這種關系依然存在。研究者進一步對包括年齡和膳食鈣攝入在內的顯著協變量進行調整后，發現卵巢癌患者低25OHD水平的可能性是對照組的3.92倍。Walentowicz-Sadlecka等[11]的研究納入了72例卵巢癌患者及65例健康女性，所有卵巢癌患者均行理想的腫瘤細胞減滅術(最大殘余癌灶直徑<1cm)，且均接受6個療程的卡鉑聯合紫杉醇化療。研究者用電化學發光免疫法測定健康女性及卵巢癌患者術前的血清25OHD濃度，結果發現卵巢癌患者的血清25OHD水平顯著低于健康對照組，且其出現低維生素D的可能性是對照組的3.71倍。研究者進一步對卵巢癌患者進行亞組分析，結果發現血清25OHD濃度與卵巢癌組織學亞型、病理分級、臨床分期及絕經情況均無明顯相關性。隨后，Granato等[12]的研究納入了61例健康婦女、45例卵巢良性腫瘤婦女及46例近期診斷為卵巢癌的婦女，結果表明，26%健康婦女、24%卵巢良性腫瘤婦女及80%卵巢癌婦女均處于低血清25OHD水平(<20ng/ml)，且卵巢癌患者的血清25OHD水平與健康女性或卵巢良性腫瘤患者比較，差異均有統計學意義。崔偉等[13]納入58例卵巢癌患者，30例卵巢良性疾病患者為卵巢良性疾病組及30例健康女性為對照組，采用化學發光法檢測血清25OHD水平，研究結果表明，卵巢癌患者的血清25OHD水平較卵巢良性疾病組和對照組顯著下降，且血清25OHD濃度在晚期患者(FIGO Ⅲ期和Ⅳ期)中顯著低于早期患者(FIGO Ⅰ期和Ⅱ期)，提示血清25OHD與卵巢癌臨床分期相關，并隨著腫瘤進展其濃度呈下降趨勢。進一步根據病理類型分析卻發現，卵巢癌患者的血清25OHD濃度與臨床病理類型(漿液性、黏液性、子宮內膜樣、透明細胞性)無關。

三、維生素D對卵巢癌細胞生物學行為的影響

1.對卵巢癌細胞增殖的影響:研究表明，維生素D與卵巢癌細胞的增殖密切相關。Thill等[14]分別用不同濃度(0.001、0.01、0.1、1、10及50μmol/L)活性維生素D(骨化三醇)處理人卵巢癌細胞株SKOV3及OVCAR3，用5-溴脫氧尿嘧啶核苷法檢測細胞的增殖情況，結果發現不同濃度(0.01、0.1、1、10及50μmol/L)骨化三醇均能顯著降低SKOV3及OVCAR3細胞的增殖活性，且與0.1%DMSO溶劑對照組比較，10μmol/L骨化三醇組的OVCAR-3細胞增殖率被抑制到了28%，SKOV-3細胞增殖率被抑制到了45%。Zhang等[15]用不同濃度(0.1、1、5、10、50、100、200及500nmol/L)的1,25(OH)2D3及(0.2、2、20、40、80及160mg/L)卡鉑處理人卵巢癌SKOV-3細胞，用細胞計數試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)檢測細胞增殖情況，結果顯示1,25(OH)2D3及卡鉑均呈劑量依賴性地抑制卵巢癌細胞增殖。與單用卡鉑組比較，1,25(OH)2D3聯合卡鉑組的抑制率顯著增加，可見兩藥聯合使用具有協同抑瘤作用。Jung等[16]采用CCK-8法檢測3種人卵巢癌細胞(SKOV3、OVCAR3、OVCA433)的增殖情況，結果顯示，50μmol/L骨化三醇與71nmol/L苗勒管抑制因子均可抑制卵巢癌細胞系(SKOV3、OVCAR3、OVCA433)的增殖，且兩者聯合應用時的抑制作用更加明顯。Abdelbaset-Ismail等[17]用不同濃度(10-10、10-9、10-8及10-7mol/L)1,25(OH)2D3處理人卵巢癌細胞株A2780，并使用流式細胞熒光分選技術計數細胞，結果顯示，與空白對照組比較，1,25(OH)2D3能明顯抑制卵巢癌細胞增殖，并呈劑量依賴性。薛昕等[18]采用不同濃度(10-9、10-8及10-7mol/L)的1,25(OH)2D3處理人卵巢癌細胞株HO8910，通過四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT]測定細胞的生長抑制率，發現與無水乙醇對照組比較，3個濃度的1,25(OH)2D3均對卵巢癌細胞的增殖具有明顯的抑制作用，并呈時間和劑量依賴性。目前認為1,25(OH)2D3主要是通過與維生素D受體(vitamin D receptor, VDR)結合而發揮生物活性作用，且細胞周期調節機制的紊亂在腫瘤的發生、發展過程中發揮了重要作用。因此，研究者進一步采用流式細胞技術進行細胞周期分析，并通過反轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)檢測VDR mRNA的表達水平，發現1,25(OH)2D3處理組的G0/G1期細胞比例較無水乙醇對照組增高，且1,25(OH)2D3使HO8910細胞的VDR mRNA的表達水平上調，提示1,25(OH)2D3通過上調VDR mRNA的表達水平來誘導卵巢癌細胞周期改變，使細胞停滯于G0/G1期，從而抑制卵巢癌細胞增殖。研究表明，p27基因作為細胞周期蛋白依賴性激酶的抑制蛋白(cyclin dependent kinase inhibitors，CDKIs)的家族成員之一，可抑制細胞進入S期，其表達水平的變化與腫瘤的發生、發展有著密切的關系。而S期激酶相關蛋白(S-phase kinase-associated protein2，Skp2)主要負責介導包括p27在內的細胞周期調控蛋白的泛素化，使細胞能從G1期進入S期，從而進行細胞增殖。李平平等[19]為研究1,25(OH)2D3對卵巢癌細胞增殖的影響及經1,25(OH)2D3作用后Skp2和p27蛋白表達變化，選取人卵巢癌細胞株HO8910作為研究對象進行體外實驗，用MTT法檢測細胞的增殖情況，發現1,25(OH)2D3呈濃度時間依賴性地抑制卵巢癌細胞增殖。流式細胞技術顯示，1,25(OH)2D3能增加G0/G1期細胞比例，減少處于S、G2/M期的細胞比例，從而降低卵巢癌細胞增殖指數。免疫細胞化學染色檢測發現1,25(OH)2D3組Skp2表達減少，而p27蛋白表達增加，提示1,25(OH)2D3可能通過減少Skp2表達，使p27蛋白表達增多，引起細胞周期改變，使癌細胞停止在G0/G1期，從而阻斷卵巢癌細胞的增殖過程。隨后，王君等[20]報道1,25(OH)2D3能呈時間及劑量效應依賴性地抑制卵巢癌HO8910細胞的增殖，且p27蛋白的表達水平隨著1,25(OH)2D3作用時間和作用劑量的增加也相應升高結果基本一致。另一方面，細胞生長調控基因GADD45是維生素D重要的靶基因。在卵巢癌細胞中，1,25(OH)2D3主要通過VDR與位于GADD45 1個外顯子的維生素D反應元件(vitamin D response element, VDRE)結合，促進GADD45基因轉錄，上調其蛋白表達水平，從而介導細胞阻滯于G2/M期[21]。程虹等[22]用10-7mol/L 1,25(OH)2D3處理人卵巢癌細胞系OVCAR3，MTT分析結果表明，與乙醇對照組比較，1,25(OH)2D3對卵巢癌細胞生長有明顯的抑制作用。流式細胞儀分析細胞周期結果顯示，1,25(OH)2D3使處于G0/G1期和G2/M期的細胞比例增多，而S期細胞比例明顯減少。免疫印跡分析Western blot法檢測結果顯示，1,25(OH)2D3使OVCAR3細胞的p27和GADD45蛋白表達增多，提示1,25(OH)2D3通過調節p27和GADD45蛋白表達水平來調控細胞周期，從而抑制卵巢癌細胞的增殖。

2.對卵巢癌細胞凋亡的影響：Zhang等[15]選取人卵巢癌SKOV3細胞系作為研究對象，將其分為4組：空白對照組、10nmol/L 1,25(OH)2D3組、40mg/L卡鉑組及10nmol/L 1,25(OH)2D3聯合40mg/L卡鉑組，用流式細胞技術檢測細胞的凋亡情況，結果發現，與空白對照組相比，1,25(OH)2D3組細胞凋亡數增加不明顯，而卡鉑組細胞凋亡數明顯增加，且1,25(OH)2D3聯合卡鉑組的細胞凋亡顯著增多。此外，研究者用共聚焦激光掃描顯微鏡下的DAPI染色觀察到了1,25(OH)2D3聯合卡鉑組細胞的DNA斷裂、染色質濃縮和凋亡小體的形成，且與單用1,25(OH)2D3或卡鉑組的細胞比較，1,25(OH)2D3聯合卡鉑組細胞的凋亡細胞核DNA片段相對較多，提示1,25(OH)2D3能明顯增強卡鉑誘導的細胞凋亡。馬淑狀等[23]為研究1,25(OH)2D3單獨及其與順鉑合用對卵巢癌細胞凋亡的影響，選取人卵巢癌細胞株HO8910為研究對象進行體外實驗。流式細胞術測定細胞凋亡率結果顯示，與細胞對照組比較，10-7mol/L 1,25(OH)2D3組和4μg/ml順鉑組均能誘導HO8910細胞凋亡；且兩者合用時細胞凋亡率較單用1,25(OH)2D3或順鉑組明顯上升。研究者進一步采用免疫細胞化學法觀察促凋亡蛋白Bax的表達變化，發現與細胞對照組比較，單用1,25(OH)2D3組和順鉑組細胞的Bax蛋白表達水平上升，兩藥合用組細胞的Bax蛋白表達較單用1,25(OH)2D3或順鉑組明顯增強，提示1,25(OH)2D3與順鉑合用能協同誘導卵巢癌HO8910細胞凋亡。Jung等[16]通過酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)測量卵巢癌細胞株(SKOV3、OVCAR3、OVCA433)的細胞DNA片段化水平來評估細胞凋亡情況，結果顯示與空白對照組比較，50μmol/L骨化三醇組DNA片段化水平在3組細胞中均明顯上升；且50μmol/L骨化三醇聯合71nmol/L苗勒管抑制因子組的細胞DNA片段化水平與單用71nmol/L苗勒管抑制因子組相比顯著增加，提示維生素D能增強苗勒管抑制因子誘導卵巢癌細胞的凋亡。該課題組進一步用免疫印跡法檢測凋亡相關蛋白(Bcl-2、BAX、caspase-3、caspase-9)的表達，結果發現與單用苗勒管抑制因子組比較，骨化三醇聯合苗勒管抑制因子組的促凋亡蛋白BAX、caspase-3和caspase-9水平升高，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平下降，提示維生素D通過激活促凋亡蛋白或抑制抗凋亡蛋白的表達來促進細胞凋亡。Abdelbaset-Ismail等[17]用不同濃度(10-10、10-9及10-8mol/L)的1,25(OH)2D3處理人卵巢癌細胞株A2780,使用流式細胞術分析發現與空白對照組比較，1,25(OH)2D3組的凋亡細胞數量明顯增加。Jiang等[24]選取OVCAR3細胞系為研究對象，用流式細胞技術檢測細胞凋亡情況，結果顯示與乙醇對照組比較，用10-7mol/L 1,25(OH)2D3處理組凋亡細胞的比例明顯增加，且1,25(OH)2D3可使細胞凋亡指數高達3.5倍。該學者進一步研究發現維生素D是通過降低體內人端粒酶反轉錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT) mRNA的穩定性，進而降低了端粒酶的活性，誘導卵巢癌細胞凋亡。高四海等[25]采用不同濃度(10-9、10-8及10-7mol/L)1,25(OH)2D3處理SKOV3細胞，采用TUNEL細胞凋亡試劑盒檢測細胞凋亡，結果顯示與乙醇對照組比較，1,25(OH)2D3處理組的SKOV3細胞核內DNA斷裂點增加，細胞凋亡率升高，且存在顯著的劑量效應關系，提示1,25(OH)2D3可通過引起SKOV3細胞DNA斷裂從而誘導卵巢癌細胞凋亡。

3.對卵巢癌細胞侵襲及遷移的影響：Abdelbaset-Ismail等[17]的研究中，采用不同濃度(10-10、10-9、10-8及10-7mol/L)的1,25(OH)2D3處理人卵巢癌細胞株A2780，使用Transwell遷移實驗檢測各組細胞的遷移情況，結果顯示與空白對照組比較，1,25(OH)2D3處理組呈劑量依賴性地抑制卵巢癌細胞的遷移。Hou等[26]選取人卵巢上皮腺癌細胞系SKOV3為研究對象，用不同濃度(1、10及100nmol/L)的1,25(OH)2D3處理細胞，通過劃痕實驗評估其遷移能力，結果顯示1,25(OH)2D3能明顯抑制卵巢癌細胞遷移，并呈時間和劑量依賴性。進一步利用Matrigel基質膠進行體外細胞侵襲能力研究，發現1,25(OH)2D3能明顯抑制卵巢癌細胞侵襲。Lungchukiet等[27]分別用乙醇對照及10-7、10-8mol/L 1,25(OH)2D3處理卵巢癌OVCAR3細胞6天，用細胞劃痕法測定細胞的運動能力，結果發現與對照組比較，經1,25(OH)2D3處理后細胞的運動能力明顯減弱，并呈劑量依賴性，提示1,25(OH)2D3能明顯抑制卵巢癌細胞遷移的能力。同時用Transwell實驗檢測10-7mol/L 1,25(OH)2D3對OVCAR3細胞遷移和侵襲能力的影響，結果顯示與乙醇對照組比較，1,25(OH)2D3能明顯抑制OVCAR3細胞的侵襲和遷移。為了進一步研究1,25(OH)2D3對卵巢癌細胞向大網膜侵襲的抑制作用，該學者選取熒光素酶標記的OVCAR3細胞，將其與小鼠離體大網膜共培養，利用熒光素酶活性檢測發現，與乙醇對照組比較，10-7mol/L 1,25(OH)2D3組的OVCAR3細胞在小鼠大網膜上定植的能力顯著降低，提示1,25(OH)2D3能夠抑制卵巢癌細胞向小鼠大網膜的侵襲。

四、維生素D對卵巢癌預后的影響

研究表明，檢測維生素D水平可用來預測卵巢癌患者的預后。Webb等[28]收集了1006例卵巢癌血清標本(670例血清樣本在診斷時收集，其余的336例在治療后收集)，用COX比例風險模型評估血清25OHD與卵巢癌生存率之間的關系，結果發現卵巢癌患者診斷時的血清25OHD濃度與生存率密切相關， 在血清25OHD濃度分別為<25nmol/L，25.0～49.9nmol/L，50.0～74.9nmol/L，>75nmol/L的卵巢癌患者中，其5年總體生存率分別為39%、45%、51%、54%，提示卵巢癌患者的生存率隨血清25OHD濃度的增加而升高；但未發現經治療后的卵巢癌患者血清中測量的25OHD濃度與生存率的關系。Walentowicz-Sadlecka等[11]用電化學發光免疫法測定72例卵巢癌患者術前的血清25OHD濃度，并根據血清25OHD濃度將卵巢癌患者分成兩組(25OHD<10ng/ml組和25OHD>10ng/ml組)，使用Kaplan-Meier生存曲線對其5年總體生存率進行分析，結果發現25OHD<10ng/ml組的卵巢癌患者中位生存期為28周，而25OHD>10ng/ml組的卵巢癌患者中位生存期為45周，提示血清25OHD濃度與好的預后密切相關。

綜上所述，低維生素D與卵巢癌的發病風險相關，尤其是在超重和肥胖婦女中。卵巢癌患者中的維生素D水平較卵巢良性腫瘤和健康女性低。維生素D能明顯抑制卵巢癌細胞增殖、侵襲和遷移，促進卵巢癌細胞凋亡，并能預測卵巢癌的5年生存率。隨著對維生素D抗腫瘤機制相關研究的不斷深入，維生素D及其類似物可以為卵巢癌的治療和預防提供新的思路。