小麥近等基因系幼穗二棱期轉錄組分析

李文靜，趙新穎，紀萌琦，郭 鑫，郭 紅，鄧志英，田紀春

(山東農業大學農學院/作物生物學國家重點實驗室/小麥品質育種研究室/山東小麥玉米周年高產高效生產協同創新中心，山東泰安 271018)

小麥是世界主要的糧食作物之一，全世界有30%以上的人口以小麥為主糧[1]。抽穗期是與小麥適應性直接相關的一個性狀，對小麥適應環境具有至關重要的作用[2-3]。小麥穗分化期根據其在分化過程中所出現的形態特征，可以分為9個時期，依次為莖葉原基分化期、生長錐伸長期、單棱期、二棱期、穎片原基分化期、小花原基分化期、雌雄蕊原基分化期、藥隔形成期和四分體形成期，其發育進程直接影響小麥抽穗開花時間[4-5]，其中，二棱期與小麥抽穗期的關系最密切[6-8]。研究抽穗期不同材料間二棱期差異表達基因，對挖掘和解析開花期相關基因、推進小麥育種進程具有重要價值。

轉錄組測序(RNA-seq)技術可以在沒有完整基因組序列的前提下，對轉錄組產物mRNA進行高通量測序，全面快速地獲得某一物種特定組織或器官在某一狀態下的完整表達信息。作為一種宏觀的整體論方法，轉錄組學改變了以往選定單個基因或少數幾個基因的研究模式，將植物功能基因組學研究帶入了一個全新的高速發展時代。利用該技術，Zhang等[9]以荔枝休眠芽和圓錐花序形成期的花芽為材料，發現大量差異表達基因富集在激素代謝和信號轉導途徑上；Kumar等[10]以小麥HD2329為材料，檢測到1 525個顯著差異表達轉錄本與高溫脅迫相關，其中27個在高溫脅迫下顯著上調；高溫明顯影響細胞代謝、蛋白質磷酸化和氧化還原過程；Wei等[11]對小麥品種農大211的籽粒和莖葉轉錄組進行高通量測序分析，檢測到61 393個基因參與籽粒發育過程，其中，7 355個差異表達基因在籽粒中上調表達，許多與糖類和蛋白質代謝相關的轉錄本和轉錄因子在籽粒中大量富集。

小麥基因組比較復雜，其穗發育分子機制的研究進展比較緩慢[12-15]。近期，Feng等[16]利用中國春進行了小麥花發育不同階段的轉錄組分析，試圖找到特定發育階段的調控基因；Wang等[17]測定了90個冬小麥品種二棱期轉錄組，并進行差異表達基因與性狀的相關性分析，發現了控制小麥穗結構的調控因子。小麥近等基因系的遺傳背景高度相似，有利于排除背景差異造成的干擾，是解析遺傳機制的良好材料。因此，本研究擬選取抽穗期明顯不同的兩個近等基因系二棱期幼穗為材料，利用RNA-seq轉錄組測序方法篩選差異表達基因，通過功能注釋與通路分析，建立小麥穗發育早期的分子學研究平臺，為解析小麥抽穗期調控機制、挖掘小麥抽穗期相關基因奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料與處理方法

從BC5的F3群體(由DH60和Y57構建，Y57為輪回親本)通過前景和背景標記選擇，篩選到背景回復率接近100%的近等基因系96-2，抽穗期與Y57相差10 d；96-2在四葉期時已達到二棱期，而Y57則在五葉期時達到二棱期。以近等基因系Y57(抽穗期196 d)和96-2(抽穗期184 d)為材料，挑選其飽滿無病害的種子在室溫下發芽后，轉移至人工智能氣候箱(浙江寧波江南儀器廠)中4 ℃春化4周。春化完成后，挑選長勢一致的植株種植在山東農業大學溫室(16 h光/8 h暗，18～25 ℃)，單株種植，每個材料種植100 株，3個重復。白天采取自然光，夜晚用白熾燈補光，使光照時間達到16 h。植株達到三葉期時開始觀察幼穗發育階段。兩天取樣一次，每個材料選取5 株健壯、生長均勻的植株，用解剖針除去葉片，在體視顯微鏡(PS24C)下進行觀察，并記錄每個時期幼穗的表型發育情況。到達二棱期時，每個材料取25～30個幼穗，立即投放到液氮中，然后保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.2 RNA文庫構建及轉錄組測序

采用Trizol提取法分別提取Y57和96-2幼穗總RNA，并用NanoDrop 2000檢測RNA濃度和OD260/OD280、OD260/OD230比值。用Agilent 2000進一步檢測RNA濃度和28S/18S比值。每個樣取1 μg總RNA，利用Oligo(dT)的磁珠富集純化mRNA；在富集得到的mRNA中加入fragmentation buffer，將mRNA進行隨機打斷；以打斷的mRNA為模板，用六堿基隨機引物合成第一條cDNA鏈，然后加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第二條cDNA鏈；利用AMPure XP beads純化cDNA；對純化的雙鏈cDNA再進行末端修復、加A尾并連接測序接頭；用AMPure XP beads選取合適大小的目的片段(300～400 bp)，通過PCR得到cDNA文庫。

文庫檢測合格之后，由北京百邁客生物科技有限公司使用HiSeq2500進行高通量測序，測序讀長為PE125。將測序得到的Raw data進行數據過濾(去除測序接頭序列、重復冗余序列、低質量序列)，獲得高質量序列數據clean data。采用TopHat2[18]將各樣品測序得到的clean data與中國春參考基因組進行序列比對以獲得mapped data。

1.3 qRT-PCR分析

從差異表達基因中挑選2個表達趨勢不同的基因，利用Primer-NCBI 在線設計軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)設計引物，對ID為Traes_5DL_9CC4EC839(F:5′ -TGAAGGCCAAGGTTGAGACA，R:5′-CGCT GGATGAATGCTGGTAGTTG)和Traes_6DL_7892214C8(F:5′-TGCGGGTCAAATGCGTC GTC，R:5′-CCAGAAGTTGCCGTCGTCCAT C)的基因進行實時熒光定量PCR 分析。將各樣品的RNA 采用第1 鏈cDNA 合成試劑盒(TaKaRa)反轉錄為cDNA,以反轉錄產物為模板,以Actin(F:5′-ACCTTCAGTTGCCCAGC AAT-3′; R:5′-CAGAGTCGAGCACAATACC AGTTG-3′)為內參,采用QIAGEN 公司的SYBR Green RT-PCR 試劑盒,利用ABI 7500熒光定量PCR儀(ABI )進行檢測。反應體系20 μL：2×Mix 10 μL，引物各(10 μmol·L-1) 0.4 μL，cDNA 2 μL，ROX校準液 0.4 μL，6.8 μL ddH2O。反應程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s ，40個循環。熔解曲線分析：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s；95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s。 每對引物均設置空白對照；3次重復。采用相對定量2-ΔΔCt法進行結果分析。

1.4 基因表達差異分析

利用FPKM[19]值反映對應基因的表達量，使用EBSeq[20]進行差異表達基因分析，獲得兩個樣品間的差異表達基因集。在差異表達基因檢測過程中，將Fold Change≥2且FDR<0.01作為篩選標準。差異倍數(fold change)表示兩樣品(組)間表達量的比值。采用Benjamini-Hochberg法校正差異顯著性P值，得到錯誤發現率(false discovery rate,FDR)。

1.5 差異表達基因功能注釋分析

使用BLAST軟件將差異表達基因與Nr(non-redundant protein sequence database in GenBank)、Swiss-Prot(Swiss-Prot protein sequence database) KEGG數據庫的序列進行比對，獲得注釋信息。利用比對軟件BLASTX，將差異表達基因與COG(clusters of orthologous groups of proteins)數據庫進行比對分析，獲得差異表達基因的COG功能注釋及其分類；利用Blast2GO[21]軟件將差異表達基因序列與GO(gene ontology)數據庫進行比對，進行功能注釋，然后利用WEGO軟件[22]對GO功能分類統計。將差異表達基因與KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)數據庫進行BLASTX比對，獲得差異表達基因相對應的Pathway注釋信息。

2 結果與分析

2.1 近等基因系幼穗發育形態及表型分析

Y57與96-2幼穗分化起始時間一致(圖1)，均在三葉期開始分化，但Y57的伸長期至單棱期和單棱期至二棱期持續時間均比96-2相應時期長。四葉期時，Y57剛進入單棱期，而96-2已處于二棱期；五葉期時，Y57到達二棱期，96-2已處于雌雄蕊分化期；七葉期時，Y57到達雌雄蕊分化期，96-2處于藥隔形成期。除了抽穗期以外，其他性狀二者均沒有顯著差異(表1)。

A～D依次為Y57伸長期、單棱期、二棱期、雌雄蕊分化期；E～H依次為96-2伸長期、二棱期、雌雄蕊分化期、藥隔形成期。

A-D indicate elongation stage,single ridge stage,double ridge stage,and pistil and stamen differential stage of Y57,resepectively; E-H indicate elongation stage,double ridge stage,pistil and stamen differential stage,and anther separation stage of 96-2,respectively.

圖1近等基因系幼穗發育動態

Fig.1Developmentofyoungspikeofnearisogeniclines

表1 近等基因系(NIL)96-2和Y57表型分析Table 1 Phenotypic data of near-isogenic lines(NIL) 96-2 and Y57

同列數據后不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

Different letters following data at same column indicate significant differences between NILs at 0.05 level.

2.2 RNA轉錄組測序產量分析

通過高通量測序，Y57和96-2分別獲得25 123 097和30 481 790條pair-end read，每個樣品均獲得6.3 G以上的堿基，各樣品Q30堿基百分比均大于85.5%(表2)，表明轉錄組測序得到的結果可靠。Y57和96-2與中國春基因組比對成功的read數量分別為38 021 371和42 375 610，占總read數的63.11%和69.51%，比對到參考基因組唯一位置的read數在clean read 中所占的比率分別為56.07%和61.59%(表2)，表明兩個樣品的read數與參考基因組的比對效率較高，可以進行下一步分析。

表2 測序數據評估及比對分析Table 2 Statistical results of sequencing data

2.3 差異表達基因分析

采用FPKM值作為衡量基因表達水平的指標，在差異表達基因檢測過程中，以Y57為對照組，將Fold Change≥2且FDR<0.01作為篩選標準。共篩選出395個差異表達基因(圖2)，其中，上調和下調基因分別為138個和257個，與Nr數據庫對比得到382個注釋基因。對篩選出的差異表達基因根據其相同或相似表達模式進行了聚類分析(圖3)，發現有6種模式，其中，基因在2個材料中的差異表達主要在前5種模式上。在上調表達基因中，表達量差異最大的2個基因均編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶2A，log2(Y57 FPKM/96-2 FPKM)值分別為7.36和5.74。

2.4 差異表達基因COG分類分析

對已注釋的382個差異表達基因進行比對和功能注釋，結果表明，在COG功能分類體系中，共有103個差異表達基因獲得了功能注釋，涉及20個COG功能類別(圖4)。其中，一般功能基因(general function prediction only)所占比例最大，有25個基因；其次為信號傳導(signal transduction mechanism)和轉錄(transcription)相關基因，分別有15和13個。

火山圖中每個點表示一個基因，紅色點表示基因表達沒有達到顯著性差異，藍色點表示基因表達達到顯著性差異。

Each dot indicates one gene. The red dot shows no significant difference of gene expression, and the blue dot is the gene expression with significant difference.

圖2差異表達基因統計及其火山圖

Fig.2Statisticsofdifferentiallyexpressedgenesanditsvalcanochart

2.5 差異表達基因GO分類分析

對已注釋的382個差異表達基因進行GO功能注釋和分類統計。共有298個基因獲得GO功能注釋，主要為細胞組分(cellular component)、分子功能(molecular function)和生物學過程(biological process) 3大類別，分別包含17、17和20個功能分類(圖5)。在細胞組分分類中，涉及細胞組分(cell part)的差異表達基因(DEG)所占比例最多，占85.23%，其次是涉及細胞(cell)和細胞器(organelle)的DEG，分別占80.53%、73.83%；而涉及到細胞外基質部分(extracellular matrix part)、膠原三聚體(collagen trimer)、病毒體(virion)及其組分(virion part)的DEG所占比例最低。在分子功能分類中，與結合相關的DEG所占比例最多，占64.42%，其次是與催化活性(catalytic activity)和核酸結合轉錄因子活性(nucleic acid binding transcription factor activity)相關DEG，分別占45.97%和12.08%。在生物學過程中，與細胞進程(cellular process)相關的DEG所占比例最多，占75.50%，其次為與代謝過程(metabolic process)相關的DEG，占74.16%；而與生物附著(biological adhesion)和運動力(locomotion)相關DEG所占比例不到0.1%。

2.6 差異表達基因KEGG通路分析

將382個已注釋的差異表達基因與KEGG數據庫進行比對，共有63個基因富集到35個KEGG通路中，其中，在光合作用-天線蛋白(photosynthesis-antenna protein,ko00196)和甘油磷脂代謝(glycerophospholipid metabolism,ko00564)通路上的富集基因顯著高于其他通路(P<0.05)。進一步分析發現，富集在光合作用-天線蛋白通路上的差異表達基因均上調表達(表3)，涉及穗發育的代謝途徑主要有植物生理節律(ko04712)、淀粉與糖代謝(ko00500)、光合作用(Photosynthesis)和植物激素信號轉導(ko04075)途徑。

2.7 功能注釋為轉錄因子的分類分析

對在nr數據庫中得到功能注釋的差異表達基因進行分析，發現功能注釋為轉錄因子的差異表達基因有19個(表4)。6 個差異表達基因屬于WRKY轉錄因子家族，它們在Y57中的表達量均顯著小于96-2。屬于Myb家族(4 個)、AP2/ERF家族(4 個)和C3H家族(2 個)的差異表達基因均下調。兩個MADS-box 基因表達趨勢相反，一個上調一個下調。這些家族轉錄因子調控植物多個生長發育過程，部分基因影響植物抽穗開花時間和花器官的形成。

不同的顏色表示每個基因表達水平的高低。

Different colours mean different gene expression levels.

圖3近等基因系間差異表達基因的熱點圖

Fig.3Heatmapofthedifferentexpressiongenesofthetwonearisogeniclines

A:RNA加工與修飾; B:染色質結構與變化; C:能量產生與轉化; D:細胞周期調控與分類，染色體重排; E:氨基酸運輸與代謝; F:核苷酸轉運輸與代謝; G:碳水化合物運輸與代謝; H:輔酶運輸與代謝; I:脂質轉運與代謝; J:翻譯，核糖體結構與生物合成; K:轉錄; L:復制、重組與修復; M:細胞壁、膜生物發生; N:細胞運動; O:蛋白質翻譯后修飾與轉運，分子伴侶; P:無機離子轉運與代謝; Q:次生代謝物合成、運輸與代謝; R:一般功能; S:功能未知; T:信號轉導; U:細胞內運輸，分泌和囊泡運輸; V:防御機制; W:細胞外基質結構; Y:核結構; Z:細胞骨架。

A:RNA processing and modification; B:Chromatin structure and dynamics; C:Energy production and conversion; D:Cell cycle control,cell division,chromosome partitioning; E:Amino acid transport and metabolism; F:Nucleotide transport and metabolism; G:Carbohydrate transport and metabolism; H:Coenzyme transport and metabolism; I:Lipid transport and metabolism; J:Translation,ribosomal structure and biogenesis; K:Transcription; L:Replication,recombination and repair; M:Cell wall/membrane/envelope biogenesis; N:Cell motility; O:Posttranslational modification,protein turnover,chaperones; P:Inorganic ion transport and metabolism; Q:Secondary metabolites biosynthesis,transport and catabolism; R:General function prediction only; S:Function unknown; T:Signal transduction mechanisms; U:Intracellular trafficking,secretion,and vesicular transport; V:Defense mechanisms; W:Extracellular structures; Y:Nuclear structure; Z:Cytoskeleton.

圖4差異表達基因COG功能分類

Fig.4COGfunctionclassificationofdifferentiallyexpressedgenes

C1:細胞組分; C2:細胞; C3:細胞器; C4:膜; C5:細胞器部分; C6:細胞膜部分; C7:大分子復合物; C8:胞外區; C9:細胞連接; C10:膜封閉腔; C11:胞外區要素; C12:核仁; C13:細胞外基質; C14:細胞外基質部分; C15:病毒體; C16:病毒體組分; C17:膠原三聚體; M1:結合; M2:催化活性; M3:轉運活性; M4:核酸結合轉錄因子活性; M5:電子載體活性; M6:結構分子活性; M7:分子轉導活性; M8:受體活性; M9:酶調節活性; M10:抗氧化活性; M11:蛋白結合轉錄因子活性; M12:營養庫活性; M13:鳥苷酸交換因子活性; M14:金屬伴侶活性; M15:翻譯調節活性; M16:蛋白標簽; M17:通道調節活性; B1:細胞反應過程; B2:代謝過程; B3:單生物體過程; B4:刺激應答; B5:生物學調控; B6:組織或生物起源細胞組件; B7:發育過程; B8:定位; B9:多細胞生物體過程; B10:生殖生長過程; B11:多生物體過程; B12:信號; B13:生長; B14:免疫系統過程; B15:生殖; B16:節律過程; B17:生物附著; B18:生物階段; B19:運動; B20:細胞致死。

C1:Cell part; C2:Cell; C3:Organelle; C4:Membrane; C5:Organelle part; C6:Membrane part; C7:Macromolecular complex; C8:Extracellular region; C9:Cell junction; C10:Membrane-enclosed lumen; C11:Extracellular region part; C12:Nucleoid; C13:Extracellular matrix; C14:Extracellular matrix part; C15:Virion; C16:Virion part; C17:Collagen trimer; M1:Binding; M2:Catalytic activity; M3:Transporter activity; M4:Nucleic acid binding transcription factor activity; M5:Electron carrier activity; M6:Structural molecule activity; M7:Molecular transducer activity; M8:Receptor activity; M9:Enzyme regulator activity; M10:Antioxidant activity; M11:Protein binding transcription factor activity; M11:Protein binding transcription factor activity; M12:Nutrient reservoir activity; M13:Guanyl-nucleotide exchange factor activity; M14:Metallochaperone activity; M15:Translation regulator activity; M16:Protein tag; M17:Channel regulator activity; B1:Cellular process; B2:Metabolic process; B3:Single-organism process; B4:Response to stimulus; B5:Biological regulation; B6:Cellular component organization or biogenesis; B7:Developmental process; B8:Localization; B9:Multicellular organismal process; B10:Reproductive process; B11:Multi-organism process; B12:Signaling; B13:Growth; B14:Immune system process; B15:Reproduction; B16:Rhythmic process; B17:Biological adhesion; B18:Biological phase; B19:Locomotion; B20:Cell killing.

表4 編碼為轉錄因子的差異表達基因Table 4 Differentially expressed genes encoding transcription factors

2.8 qRT-PCR結果驗證

從差異表達基因中挑選4個表達明顯不同的基因進行驗證，其中2個是表達趨勢不同的基因(Traes_5DL_9CC4EC839和Traes_6DL_7892214C8)，另外2個是表達量顯著不同的基因(Traes_5DL_52EC7112A和Traes_3DS_92091AAD4)。利用實時熒光定量PCR分析這4個基因在2個材料中的相對表達水平，對轉錄組數據進行可靠性驗證。結果發現，4個基因的轉錄組測序結果與熒光定量結果一致(圖6)；通過對三個不同發育時期的轉錄組測序基因表達水平和基因相對表達量的相關性分析可知，Traes_5DL_9CC4EC839和Traes_6DL_7892214C8基因在YM57和96-2中的相關系數分別為0.951，0.644，0.994和0.961； Traes_3DS_92091AAD4和Traes_5DL_52EC7112A.2基因在YM57和96-2中的相關系數分別為1、0.667、1和0.762，都達顯著水平，表明轉錄組測序結果可靠。

A、C、E、G為轉錄組測序結果，B、D、F、H為RT-PCR結果; A和B是基因Traes_5DL_9CC4EC839的驗證結果；C和D是基因Traes_6DL_7892214C8的驗證結果；E和F是基因Traes_3DS_92091AAD4的驗證結果；G和H是Traes_5DL_52EC7112A.2基因的驗證結果;4L、5L、7L分別代表四葉期、五葉期、七葉期。

A,C,E,G are the result of transcriptome sequencing；B,D,F,H are the result of qRT-PCR; A and B are the result of the gene Traes_5DL_9CC4EC839；C and D are the result of the gene Traes_6DL_7892214C8; E and F are the result of the gene Traes_3DS_92091AAD4;G and H are the result of the gene Traes_5DL_52EC7112A.2; 4L，5L，7L are the 4th leaf age,the 5th leaf age,the 7th leaf age,respetively.

圖6轉錄組測序結果與RT-PCR結果比較

Fig.6ComparisonofRNA-seqversusqRT-PCRdataforselectedgenes

3 討 論

生產上普遍種植的小麥是異源六倍體，含有A、B、D三個基因組，基因組大約17 G。普通小麥的形成涉及3個原始祖先物種和兩次天然雜交，烏拉爾圖、擬斯卑爾托山羊草和粗山羊草分別是小麥A、B、D基因組的供體[23]。雖然目前A和D基因組測序和草圖繪制已經完成[24-25]，與水稻、玉米等作物相比，小麥分子基礎研究還很薄弱，遺傳背景了解還比較少。近幾年來基于Illumina 測序平臺的RNA-seq技術已成為快速而全面地建立植物分子基礎平臺的有力工具[26-27]。

小麥穗發育是一個受多基因和環境調控的復雜過程，二棱期是與小麥抽穗期關系最密切的時期。本研究利用RNA-seq測序技術獲得Y57和96-2比對到參考基因組(中國春)上的reads數分別為38 021 371和42 375 610，但是2個材料在二棱期僅篩選出395個差異表達基因，其中上調基因138個，下調基因257個。這也說明了Y57和96-2遺傳背景高度一致，減少了遺傳背景對差異表達基因篩選的影響。而Feng等[16]利用普通小麥中國春進行了小麥花不同發育時期的轉錄組分析，其中找到在二棱期特異表達的基因464個，這些基因主要富集在核酸綁定(nucleic acid binding)、轉錄調控活性(transcription regulator activity)、轉錄因子活性(transcription factor activity)及DNA綁定等功能。將本研究找到的這些差異基因在Nr數據庫進行注釋，其中382個基因獲得了功能注釋；有298個基因獲得GO功能注釋，這些差異表達基因的功能也主要集中在結合(binding)、催化活性(catalytic activity)和核酸結合轉錄因子活性(nucleic acid binding transcription factor activity)等方面，與Feng等[16]研究結果類似。Wang等[17]利用90個冬小麥品種在二棱期早期及小穗原基形成期進行了轉錄組分析，并將獲得的差異表達基因與穗部相關性狀進行了相關性分析，發現小穗數與基因表達水平呈顯著相關，其次是小花數和穗粒數; 由此可知，二棱期是小麥穗部發育形成的關鍵時期。對本研究獲得的差異基因進行COG功能注釋，有103個基因獲得COG功能注釋，只有63個基因被注釋到KEGG代謝通路中。注釋基因信息之所以缺失，一方面可能是因為小麥基因組測序還沒有完成，無法對整個基因組進行功能注釋; 另一方面，目前對小麥轉錄組學研究還處于初級階段，現在的研究主要集中在小麥抗逆性方面[14,28]，基因功能注釋信息不夠豐富，生物信息數據庫還不夠完善，部分序列或基因無法獲得相應的功能注釋信息。

本研究發現，Traes_5DL_52EC7112A和Traes_3DS_92091AAD4為絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶2A同源基因，且它們在Y57中幾乎不表達而在96-2中表達量較高。Janssens等[29]和Yu等[30]都表明絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶2A(PP2A)在信號轉導和細胞生長、分化方面起重要的調控作用，能夠促進植物生長發育。擬南芥的PP2A顯著影響生長素轉運[31]。由此推測，這兩個基因可能與小麥幼穗分化有關，對小麥抽穗期有正調控作用。

本研究中，差異表達基因中有多個WRKY、MADS-box、Myb-like和ERF/AP2轉錄因子。ERF/AP2和WRKY轉錄因子是許多植物生長發育過程，如應答生物和非生物脅迫、種子萌發、ABA信號轉導等的主要調控因子。Kiseleva等[32]認為ERF/AP2和WRKY轉錄因子可能影響小麥抽穗期，在大豆[33]和芒草[34]中也發現了控制開花期的WRKY轉錄因子。已有大量研究證明MADS-box基因家族參與生長點的確定、春化過程、開花時間調控和果實成熟等多個重要發育過程[35-37]。在擬南芥中發現Myb-like家族轉錄因子是晝夜節律鐘和花青素合成途徑中的調控因子[38]，晝夜節律鐘可以通過調控下游基因的表達控制植物開花時間。Myb-like家族轉錄因子對小麥抽穗期的作用還需要進一步研究。

在生物體內，不同的基因產物相互協調行使生物學功能，對差異表達基因的通路注釋分析有助于進一步解讀基因的功能。本研究KEGG分析結果表明，差異表達基因顯著富集在光合作用-天線蛋白和甘油磷脂代謝通路上。篩選到參與光合作用-天線蛋白通路中的Lhca2、Lhcb1、Lhcb2、 Lhcb3和Lhcb4差異表達基因均上調表達。它們是光系統Ⅰ和光系統Ⅱ的組成部分，參與光吸收和光信號轉導。在光周期控制開花反應中，植物通過光受體感受外界的光信號并將光信號傳遞到晝夜節律鐘系統控制植物的開花時間[39]，推測這些基因可能通過光周期途徑正調控小麥抽穗期。對甘油磷脂代謝通路對穗發育的影響還有待于進一步研究。本研究還對差異表達基因進行了GO和COG功能分類，差異表達基因主要涉及植物生長發育細胞部分、結合、細胞運輸過程、代謝過程、信號轉導機制和轉錄等，說明參與小麥幼穗分化前期差異表達基因主要集中于細胞內，DNA、RNA和蛋白質等代謝旺盛，為細胞分裂、生長和分化提供信息、能量和物質基礎。