雞糞及其配施尿素對甜瓜香味物質、酶活性及基因表達的影響

靳亞忠, 陳業雯, 陸 淼,張 森, 蘭 慧，何淑平, 齊紅巖

(1.黑龍江八一農墾大學園藝園林學院，黑龍江 大慶 163319；2 .沈陽農業大學園藝學院，遼寧 沈陽 110866)

薄皮甜瓜(Cucumismelovar.makuwaMakino)，一種重要的甜瓜栽培品種類型，其成熟果實香味濃郁、脆甜多汁、口感優良，是一種良好的消暑水果，深受消費者的喜愛。香味物質是衡量甜瓜風味品質的重要指標之一，且果實中香味的濃烈程度受揮發性物質的種類、含量和組成的影響[1-5]。甜瓜果實香味物質主要包括酯類、醇類、醛類、酮類、酸以及含硫化合物等[3,5-6]。許多研究已表明薄皮甜瓜成熟果實中主要呈香物質是酯類物質，其中乙酸乙酯、乙酸己酯、乙酸正己酯、乙酸-2-甲基-1-丁酯、乙酸苯甲酯、2-甲基丁酸乙酯、異丁酸乙酯、乙酸-2-甲基丙酯等為其果實特征性香氣物質[1-2,4]。此外，甜瓜品種、果實成熟度、果實部位、嫁接以及外源物質等影響了果實中香氣物質的種類、含量及其組分比例，進而導致了香味的差異[3-4,7-9]。在番茄[10-11]、桃[12-15]、藍莓[16]、烤煙[17]中的研究也表明外源物質處理、貯藏、栽培措施、光質、施肥等措施促進或抑制了果實或煙草中香氣物質的合成。

甜瓜屬于喜肥作物，對氮、鉀的需求量較多，但是在設施栽培中，一定的氮肥施用范圍內，氮肥可以提高甜瓜果實產量，而過量施用氮肥卻降低了產量以及可溶性糖分含量、Vc等品質指標[18]；此外，潛宗偉等[19]研究發現水培營養液中100%氮素用量處理的甜瓜果實中乙酸丁酯、乙酸-2-甲基丙基酯和2-甲基丁酸乙酯等特征性香氣物質含量最高，但隨著氮素用量的增加，這些特征性酯類物質含量則有所降低。在煙葉中也發現，氮肥過量施用降低了相同節位葉片中特征性香味物質——茄酮和新植二烯的含量[17,20]。為了提高生產中的肥料利用以及果實品質，國家實行了減肥減藥的戰略計劃，利用有機肥進行化學氮肥的替代是策略之一。在紅富士蘋果栽培中，有機肥替代化肥使用，提高了果實中特征香氣物質——乙酸己酯、丁酸己酯、丁酸-2-甲基己酯的含量，并促進了(S)-2-甲基-1-丁醇和(E )-2-己烯醛的合成，提高了蘋果風味品質[21]；在鴨梨栽培中，施用有機肥提高了果實總糖和總酸含量，也提高了果實中香氣物質種類和含量，尤其是特征性香氣物質——乙酸己酯、丙酸乙酯、2-甲基丙酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、α-法尼烯的含量，且賦予了果實果香味[22]。有機肥改變了桃果實香氣物質種類和含量，尤其是提高了特征性香氣物質——內脂的種類和含量，降低了C6醇類和醛類物質合成，促進了果實甜香味和果香味的形成[23-24]，雞糞的使用促進了肥城桃果實特征性酯類——乙酸丙酯、甲酸甲酯、乙酸己酯和丙酸甲酯的合成[24]。此外，利用有機肥替代化學氮肥提高了煙葉特征性香味物質——新植二烯、法尼基丙酮、茄酮、苯乙醇的含量[25]。由此可知，有機肥的使用可以改變果實香氣物質的種類、含量以及組分比例，進而影響果實的香味，但是有機肥是如何通過香氣物質代謝途徑調節其合成，鮮有報道。在甜瓜果實中，許多研究已經表明甜瓜果實香氣物質的合成與脂氧合酶(LOX)、氫過氧化物裂解酶(HPL)、乙醇脫氫酶(ADH)、醇酰基轉移酶(AAT)、氨基轉移酶等酶活性及其基因家族成員相關[9,26-31]，但是有機肥如何影響香氣物質代謝途徑中關鍵酶活性及酶基因的表達，進而調控香氣物質的合成，還未見報道。因此，本試驗研究采用基質栽培的方式，以薄皮甜瓜“DX108”為試材，研究雞糞替代或與尿素配施對甜瓜果實香氣物質合成的影響，旨在探討雞糞調控甜瓜果實香氣物質合成的可能生理機理，為有機肥替代化學氮肥在甜瓜優質綠色栽培中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

盆栽試驗采用基質栽培的方式進行，基質為草炭∶河沙=3∶1比例配置的混合基質，每桶裝填10 kg基質。供試薄皮甜瓜為黑龍江八一農墾大學園藝系甜瓜課題組繁育的“DX108”自交系品種(花后30～33 d成熟)，采用穴盤進行育苗，當幼苗長出第4片真葉時，選取生長大小基本一致、無病蟲害的幼苗定植于桶中進行種植，每桶定植1株甜瓜幼苗。

供試肥料為常規肥料：尿素(含N為46%)、含磷(P2O5)46.0%和含N 21.2%的磷酸二銨和含鉀(K2O)34.3%的硫酸鉀；試驗用雞糞為商品雞糞：含全氮1.46%，含磷(P2O5)0.74%，含鉀(K2O) 0.75 %，由黑龍江牧康牧業有限公司提供。

1.2 試驗設計

試驗設置為對照(CK)為化學肥料處理(純N 600 mg·kg-1、P2O5300 mg·kg-1和K2O 300 mg·kg-1)，該處理中尿素用量為10 g·pot-1、磷酸二銨用量為6.52 g·pot-1、硫酸鉀用量為8.74 g·pot-1；A處理為純N 300 mg·kg-1+雞糞(純N 300 mg·kg-1)，其中雞糞的用量為205 g·pot-1，尿素的用量為5.04 g·pot-1，磷酸二銨的用量為3.22 g·pot-1，硫酸鉀的用量為4.26 g·pot-1；B處理為雞糞處理，所用雞糞的量根據純N 600 mg·kg-1來計算，其用量為410 g·pot-1，且雞糞中含磷(P2O5)為303 mg·kg-1,含鉀(K2O)為308 mg·kg-1，與CK處理中肥料的總磷、總鉀用量相接近，因此該處理沒有額外添加磷酸二銨和硫酸鉀。在桶中填混合基質時，CK處理50%的氮、磷、鉀肥料以基肥的形式混合到土中，其余的肥料再平均分成2份，分別在甜瓜植株伸蔓期和果實坐果后進行追施；A和B處理所用到雞糞以及磷鉀肥，在裝填桶時與基質混合均勻，裝填入桶中。每個處理18桶，3次重復，每個重復6個桶，按照隨機區組方法進行排列，放置于黑龍江八一農墾大學園藝園林學院實驗基地的塑料大棚中進行栽培，各處理澆水、病蟲害防治都按照統一的管理方式進行。甜瓜植株按照單蔓整枝方式進行管理，子蔓結瓜，瓜前留1片葉進行摘心。在甜瓜果實開花當天進行人工授粉，并掛標簽進行標記，分別在花后果實生長的第20、25、30、35 d進行甜瓜果肉樣品采集，樣品放置于-40℃和-80℃冰柜中進行貯藏，用于各項指標的測定。

1.3 測定項目與方法

香氣物質測定：采用頂空固相微萃取(SPME) 技術提取不同處理薄皮甜瓜果實香氣成分，經氣相色譜-質譜聯用儀(GC-MS) 進行測定分析，參照齊紅巖等采用的檢測方法進行測定[9]。

香氣物質合成關鍵酶活性測定：LOX酶活性、氨基轉移酶、ADH酶以及AAT酶活性參照李巖的方法進行測定[7]。

實時熒光定量基因表達分析：果實組織總RNA的提取按照ultrapure RNA Kit(北京康為世紀生物科技有限公司，北京)試劑盒中提供的操作方法進行。獲得的RNA用RNase-free 無菌水30μL進行溶解，并用DNAse I (Promega, Madison, WI, USA)在37℃下處理50 min，去除基因組DNA污染，并進行重新沉淀和濃縮。qRT-PCR采用反應體系為20 μL，采用的試劑盒為SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)(Cat.FP205,天根,北京,中國)，并使用ABI PRISM7500熒光定量PCR儀進行測定。qRT-PCR的反應條件如下：50℃，2 min；95℃，10 min；95℃，45個循環，15 s；60℃，1 min；每個樣品的qRT-PCR都進行3次重復，cDNA來自3個生物學重復的樣品。試驗中以18SrRNA DNA (148 bp)作為內參基因，ADH基因和AAT基因家族成員表達引物見表1，樣品Ct值是由擴增曲線計算獲得的。

1.4 數據處理與統計分析

采用Excel 2010和SPSS.19軟件對數據進行處理和統計分析，采用Duncan 新復極差法進行顯著性分析，Origin 8.0軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同施肥處理對薄皮甜瓜果實香氣物質種類及含量的影響

由表2可以看出，薄皮甜瓜果實中香氣物質主要由醇類、醛類、酯類、酸類物質組成，且隨著果實的發育這些香氣物質種類以及總含量發生變化，不同施肥處理的果實之間存在顯著差異(P<0.05)。尿素單獨處理(CK)果實中，隨著果實發育，醇類、醛類、酯類、酸類物質種類逐漸增多；雞糞+尿素(A)和雞糞(B)處理的果實中酯類物質種類逐漸增多，而醇類、醛類種類減少。對于這些香氣物質總含量而言，在各個時期尿素(CK)處理的甜瓜果實中香氣物質主要以醇類和醛類物質為主，酯類物質次之，尤其是C6+C9醇類和醛類物質含量明顯高于雞糞+尿素以及單獨雞糞處理(圖1)；而雞糞+尿素(A)和雞糞(B)處理的果實中香氣物質則以酯類物質為主，醇類和醛類次之，尤其是乙酸酯類物質含量顯著高于CK(圖1)。此外，在尿素(CK)單獨處理的甜瓜果實中酯類物質總含量隨著果實發育呈現先升高而后降低的現象，而其它兩個處理果實中酯類物質總含量則呈現逐漸升高的趨勢，且在果實成熟的后期(30 d和35 d)，雞糞+尿素(A)處理的果實中酯類物質總量明顯高于雞糞(B)處理的果實中酯類總含量(P<0.05)。

2.2 不同施肥處理對薄皮甜瓜果實中主要酯類物質含量的影響

表3中列出的為果實中含量較高和因施肥處理不同而變化強烈的酯類物質，其中包含一些甜瓜果實特征性酯類物質。由表3可知，乙酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、2-甲基丁基乙酸酯是薄皮甜瓜果實中含量較高的酯類物質，隨著果實發育，其含量呈現增加趨勢，但是雞糞+尿素(A)處理果實中2-甲基丁基乙酸酯含量先升高而后降低。總體來看，與雞糞+尿素以及雞糞單獨處理相比較，單獨尿素處理(CK)的甜瓜果實中沒有檢測到2-甲基丁酸甲酯、2-乙基丁酸乙酯、乙酸香葉酯、甘油亞麻酸酯、乙酸異丁酯、異丁酸乙酯、正癸酸正癸酯、水楊酸甲酯；只在花后30 d或35 d的果實中檢測到丙酸乙酯、丁酸乙酯、2-甲基乙酸丁酯、異丁酸丁酯、辛酸乙酯、乙酸仲丁酯、乙酸戊酯，且含量較低。雞糞+尿素和雞糞處理明顯提高了花后30 d或35 d果實中乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸丁酯、2-甲基乙酸丁酯、2-甲基丁基乙酸酯、乙酸苯甲酯、甘油亞麻酸酯、乙酸異丁酯、異丁酸丁酯、己酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸己酯的含量，尤其是雞糞的施用顯著促進了甜瓜特征性香氣物質乙酸乙酯、乙酸己酯、丁酸乙酯、乙酸苯甲酯、乙酸異丁酯、己酸乙酯含量的增加。

表2 不同施肥處理對薄皮甜瓜果實中香氣物質種類和含量的影響

圖1 不同施肥處理對薄皮甜瓜成熟果實中乙酸酯類、非乙酸酯類、C6+C9醇類和醛類含量的影響Fig.1 Effects of different fertilization treatments on the contents of acetate esters, non-acetate esters,C6+C9 alcohols and aldehydes in melon ripe fruits

2.3 不同施肥處理對薄皮甜瓜果實中香氣物質合成相關酶活性的影響

由圖2可知， 花后20 d時，各處理之間LOX酶活性差異不顯著，但在25 d之后，雞糞+尿素(A)和雞糞(B)處理甜瓜果實中LOX酶活性迅速升高，在30 d時達到峰值，之后又降低，且顯著高于單施尿素處理(CK)(P<0.05)。雞糞單獨處理果實中氨基轉移酶活性始終高于單施尿素處理，在35 d的果實中處理之間差異顯著(P<0.05)；而雞糞(B)與雞糞+尿素(A)處理之間相比，只在花后20～30 d期間和35 d果實中氨基轉移酶活性呈現差異(P<0.05)。此外，單施尿素處理(CK)與雞糞+尿素(A)處理甜瓜果實中氨基轉移酶的活性，僅在花后35 d差異顯著(P<0.05)。

ADH和AAT酶是果實中酯類香氣物質合成途徑中下游的關鍵調節酶。由圖2可知，等氮量條件下，在花后20 d，單施尿素(CK)處理甜瓜果實中ADH酶活性顯著高于雞糞(B)以及雞糞+尿素(A)處理(P<0.05)。隨著果實的發育，尿素處理果實中ADH酶活性呈現出先降低而后升高的趨勢，而雞糞(B)以及雞糞+尿素(A)處理果實中ADH酶活性逐漸升高，在花后30 d時達到峰值，之后降低，且在花后30 d時，ADH酶活性稍高于尿素；但在花后35 d時，則顯著低于尿素(CK)處理(P<0.05)。此外，3種處理甜瓜果實中AAT酶活性，隨著果實發育都顯示出先升高，在花后30 d時達到峰值，之后呈現降低的趨勢。雞糞(B)、雞糞+尿素(A)處理果實中AAT酶活性在花后30 d時顯著高于單施尿素(CK)處理(P<0.05)，在花后35 d時，雞糞+尿素(A)處理果實AAT酶活性明顯大于單施尿素(CK)和雞糞(B)處理，而單施尿素(CK)與單施雞糞(B)處理之間果實中AAT活性無顯著差異(P<0.05)。

2.4 不同施肥處理對薄皮甜瓜果實中香氣物質合成相關酶基因表達的影響

由圖3可知，甜瓜果實中CmADH1和CmADH2的表達量隨著果實發育呈現出逐漸升高的趨勢，且處理之間差異顯著(P<0.05)。尿素單獨處理(CK)促進了花后30 d和35 d甜瓜果實中CmADH1和CmADH2的表達，這2個基因的表達量顯著高于雞糞(B)和雞糞+尿素處理(A)(P<0.05)。雞糞+尿素(A)處理增加了花后20 d和25 d果實中CmADH1的表達量，而雞糞(B)處理提高了花后20 d和25 d果實中的CmADH2的表達量(P<0.05)。

尿素、雞糞以及雞糞+尿素處理對CmAAT1、CmAAT2和CmAAT3表達的影響也存在差異(圖4)。尿素處理(CK)減弱了CmAAT2和CmAAT3在果實中的表達，而雞糞+尿素(A)以及雞糞(B)處理顯著促進了CmAAT3基因在花后20～35 d果實中的表達，且雞糞+尿素(A)處理提高了CmAAT1和CmAAT3在花后30 d和35 d果實中的表達水平，而且顯著高于尿素(CK)和雞糞(B)單獨處理(P<0.05)。

表3 不同施肥處理對薄皮甜瓜果實中主要酯類香氣物質含量的影響

3 討 論

有機肥在果蔬上的施用對果菜品質具有重要的作用，在提高果蔬品質方面的效果已被證實。有機肥可以提高肥城桃果實中可溶性固形物、Vc、固酸比、蔗糖和總糖含量以及桃果實中特征性香氣物質含量和種類，賦予了果實果香和甜香味[23-24]；在蘋果[21]、香蕉[32]、鴨梨[22]的栽培中也發現，施用有機肥提高了果實中“酯香型”和“果香型”酯類物質含量，同時也增加了酯類物質種類，且雞糞的施用促進了肥城桃果實中特征性酯類——乙酸乙酯、乙酸丙酯、甲酸甲酯、乙酸己酯和丙酸甲酯的積累[25]，這與本文的研究結果相似。本文詳細分析了雞糞、雞糞+尿素以及尿素處理對薄皮甜瓜香氣物質合成的影響，發現雞糞、雞糞+尿素處理降低了果實中C6和C9醇、醛的種類和含量，而促進了“酯香型”物質——丁酸乙酯、乙酸乙酯含量的增加，提高了果香型物質——丙酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯的含量，賦予了甜瓜果實濃郁的酯香味和果香味；而單獨尿素處理果實中C6和C9醇、醛的種類和含量顯著高于雞糞以及雞糞+尿素處理，因此果實呈現出了青香味。另外，本研究還發現雞糞+尿素處理成熟果實中酯類物質的種類和含量高于雞糞單獨處理，同時也發現2-乙基丁酸乙酯、乙酸香葉酯和水楊酸甲酯只在雞糞處理果實中測出，而丁酸戊酯和異丁酸乙酯僅在雞糞+尿素處理的果實中測出，因此這些酯類物質種類和含量的差異導致了果實香味的差異。在煙草中，有機肥的使用也促進了煙葉中特征性香氣成分新植二烯、法尼基丙酮、茄酮、苯乙醇的含量，改變了煙草風味[17]。由此可知，有機肥——雞糞的施用主要是通過調節果實中酯類物質，尤其是特征性“酯香型”和“果香型”物質種類和含量而改變薄皮甜瓜果實香味品質的。

圖2 不同施肥處理對薄皮甜瓜果實香氣物質合成關鍵酶活性的影響Fig.2 Effects of different fertilization treatments on the activities of enzyme responsible for aromas synthesis in fruits of oriental melon

圖3 不同施肥處理對薄皮甜瓜果實中CmADH1和CmADH2基因表達的影響Fig.3 Effects of different fertilization treatments on the expressions of CmADH1 and CmADH2 in fruits of oriental melon

圖4 不同施肥處理對薄皮甜瓜果實中CmAAT1、CmAAT2和CmAAT3基因表達的影響Fig.4 Effects of different fertilization treatments on the expressions of CmAAT1, CmAAT2 and CmAAT3 in fruit of oriental melon

已有研究表明，薄皮甜瓜果實中香氣物質的合成積累與其合成途徑中LOX酶、氨基轉移酶、ADH酶、AAT酶活性以及關鍵限速酶基因表達相關[26,28-29,33-34]。在薄皮甜瓜中，嫁接方式降低了成熟果實中脂氧合酶(LOX)、醇脫氫酶(ADH)和醇酰基轉移酶(AAT)的活性，還降低了CmADH1和CmADH2以及CmAAT1和CmAAT2的轉錄水平，進而影響了果實中香氣物質的種類和含量，尤其是特征性酯類物質種類和含量[9,35]。李映暉等[32]研究表明，增施魚粉提高了香蕉和粉蕉果實中醇脫氫酶(ADH)和醇酰基轉移酶(AAT)活性，且與果實揮發性物質總量和種類的增加呈現明顯的相關性。在本研究中發現，雞糞部分替代和全替代化學氮肥條件下，明顯提高了花后30 d和35 d果實中LOX酶活性、氨基轉移酶活性、AAT酶活性以及25～30 d期間ADH酶活性；尿素明顯促進了30 d后果實中CmADH1和CmADH2基因的表達水平，而雞糞以及雞糞與尿素配施處理促進了30 d或35 d果實中CmAAT1、CmAAT2和CmAAT3的表達水平，與果實中酶活性變化不完全一致，可能果實中還存在其它家族成員參與了果實中相對應酶活性的調節[26,28]。同時依據甜瓜果實中香氣物質的種類和含量變化，發現尿素處理促進了CmADH1和CmADH2轉錄豐度的提高，可能是該處理甜瓜果實C6和C9醇醛類物質較高的原因之一。因此，雞糞以及雞糞與尿素配施可能是通過調節果實發育期間香氣物質合成關鍵酶活性之間的相互協調作用，以及調節關鍵限速酶基因CmADH和CmAAT家族成員的轉錄水平，影響了香氣物質的合成，尤其是促進了酯類物質合成的限速酶——AAT酶活性及CmAAT基因家族成員在不同時期的表達，進而調節了酯類物質的合成，提高了果實香味品質。但是，有機肥——雞糞的施用是如何通過一個調控網絡調節香氣物質合成的分子機制還不清楚，需進一步進行探討。

國內外許多研究已經證明，在化學氮肥減量的情況下，有機肥或生物有機肥的施用能夠明顯促進土壤脲酶、蔗糖酶、多酚氧化酶、中性磷酸酶、蛋白酶等土壤酶活性的提高[36]以及土壤有益菌群數量、有效養分、腐殖酸以及有機質含量的增加，提高了土壤肥力和生物活性[37-39]，改善了土壤氮的代謝特性，進而改善了果實風味品質[40]。但是，有機肥是如何通過調節土壤-植物-微生物的互作進而調節果實品質的機理還不明確。Gaudinier 等[41]研究發現氮的吸收、運輸、代謝以及提高氮素有效性的分子調控網絡中包含有轉錄因子、氮素和氨基酸代謝途徑、碳代謝途徑以及激素信號途徑中的關鍵基因、Ca2+受體蛋白激酶等，因此，有機肥以及有機肥與化學氮肥的配施可能是通過氮信號、糖信號或激素信號的傳遞，啟動了轉錄因子對甜瓜植株體內氮素代謝途徑關鍵酶基因的表達調控，從而引發植物體內香氣物質代謝網絡發生變化，促進了甜瓜果實中香氣物質的合成。這種推測還需通過分子生物技術、生物化學等方法進一步驗證。

4 結 論

尿素、雞糞以及雞糞+尿素處理對薄皮甜瓜果實香氣物質合成的影響不同；尿素的施用顯著提高了果實中C6、C9醇醛物質含量和種類，而雞糞、雞糞+尿素的處理則促進了酯類物質合成和種類的增加，尤其是“酯香型”和“果香型”酯類香氣物質的含量，而雞糞和尿素的配施對成熟果實中乙酸酯類和非乙酸酯類特征性香氣物質的影響較大。雞糞以及雞糞和尿素配施是通過調節果實香氣合成相關酶活性之間相互協調作用，調節了香氣物質的合成，另一方面，還從轉錄水平促進了酯類香氣合成關鍵酶基因的表達量，最終影響了果實的香氣成分變化和香味品質。