耐重金屬苜蓿中華根瘤菌的篩選及其與能源植物聯合富集銅的特性

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(農業部農業環境微生物重點實驗室，南京農業大學生命科學學院，江蘇 南京 210095)

能源植物(energy plant)指那些利用光能效率高，具有合成較高還原性烴、可產生接近石油成分和替代石油使用產品的植物，以及富含油脂、糖類、淀粉類、纖維素等的植物[1-4]。柳枝稷(Panicumvirgatum)、芒(Miscanthussinensis)、紫花苜蓿(Medicagosativa)、多年生黑麥草(Loliumperenne)和甜高粱(Sorghumbicolor)等富含木質纖維素和糖類的植物，因材料豐富，價格低廉，且不涉及糧食安全問題而成為當前能源植物的首選[5-7]。

由于中國農業可耕地嚴重不足，人多地少的國情決定了我國不可能用現有耕地、良田發展能源農業，在邊際土地上發展能源植物是生物質能源最有前景的策略之一[8]。近年來研究者已嘗試在荒山荒坡、鹽堿地、尾礦區、排土場等邊際土壤上種植能源植物。余海波等[9]利用能源植物進行的銅尾礦修復試驗中荻(Triarrhenasacchariflora)和蘆竹(Arundodonax)存活較多。Desjardins等[10]發現在重金屬污染土壤中高羊茅(Festucaarundinacea)比苜蓿富集更多銅。Peralta-Videa等[11]發現紫花苜蓿可以吸收銅、鎳、鋅和鎘。由此可見，受采礦業影響的土地普遍存在嚴重的水土流失和重金屬污染等諸多生態環境問題，能源植物對重金屬污染邊際土壤的適應具有選擇性。

為了提高能源植物的修復效率，研究者嘗試通過添加土壤改良劑和植物促生微生物等措施，促進能源植物的生長和富集重金屬[12]。楊何寶等[13]發現施肥和接種苜蓿根瘤菌可以促進苜蓿生長，但對鐵尾礦砂理化性質的改善作用不顯著。Poor等[14]發現在0.1 mmol·L-1CuCl2脅迫下，添加300 mmol·L-1EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid)處理可以提高甜高粱莖干的光合作用、干重、糖含量和總銅積累量。Babu等[15]篩選到兩株促生真菌PenicilliumaculeatumPDR-4和Trichodermasp. PDR-16，當用兩株真菌接種甜高粱×蘇丹草(Sorghumbicolor×sudanense)時，可以促進植物中砷、銅、鉛和鋅含量增加，而且土壤重金屬有效態含量和有效P含量、植物生物量、葉綠素以及植物中砷、鉛和鋅含量也顯著提高。Verdugo等[16]利用污泥、石灰和接種菌根真菌，提高了銅尾礦上黑麥草的生物量、葉綠素含量以及銅積累量。植物根際促生細菌(plant growth-promoting rhizobacteria, PGPR)是自由生活在土壤或附生于植物根系的一類可促進植物生長和礦質營養吸收利用的有益菌類[17]，可避免菌根真菌的難以擴大培養、真菌潛在致病性等問題，目前作為重金屬耐性植物適應環境脅迫如營養物質匱乏、干旱、重金屬污染的有效策略，逐漸成為國內外重金屬污染修復的研究熱點[18-20]。但植物促生細菌能否與能源植物建立良好、安全的互惠關系，發揮根際效應提高修復效率，還需進一步探討。

本研究通過篩選耐重金屬的根瘤菌，利用根瘤菌促進紫花苜蓿和高生物量的多年生黑麥草、甜高粱等能源植物生長，以期建立耐重金屬根瘤菌-能源植物聯合修復的優良組合，促進礦區土壤理化性質的改善，為在礦區廢棄地等邊際土壤上可持續生產生物質能源、修復重金屬污染土壤提供資源和有效途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試土壤：采集自南京某銅礦廢棄地(119°05′ N, 32°04′ E)土壤(0～20 cm表層土)。土壤有機質(8.5±0.3) g·kg-1，總Cu(1730.3±15.4) mg·kg-1，pH(6.7±0.1)。風干后過2 mm篩備用。

培養基：YMA固體培養基(甘露醇5.0 g，酵母粉1.0 g， K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.1 g，CaCO33.0 g，去離子水1000 mL，pH 7.0，瓊脂粉18.0 g)，TY液體培養基(胰蛋白胨5.0 g，酵母粉3.0 g，無水CaCl20.6 g，H2O 1000 mL，pH 7.0)。

無氮營養液：MgSO4·7H2O 0.10 g，CaSO40.46 g，K2HPO40.14 g，KCl 0.75 g，檸檬酸鐵0.075 g，H2BO32.86 mg，MnSO41.81 mg，ZnSO42.20 mg，CuSO4·5H2O 0.80 mg，H2MoO40.02 mg，去離子水1000 mL。

供試植物：紫花苜蓿(M.sativa)、多年生黑麥草(L.perenne)、甜高粱(S.bicolor)，購自江蘇省南京市棲霞區春茵種子有限公司。

1.2 多金屬耐性根瘤菌的分離篩選及鑒定

采集生長于南京市某銅礦廢棄地土壤中的紫花苜蓿，用水沖洗干凈。選取主根上飽滿、直徑大的粉紅色根瘤，用無菌剪刀剪下，放入75%乙醇浸泡消毒2～3 min，用無菌水洗2～3次，再用3% NaClO溶液浸泡5 min，最后用無菌去離子水清洗5～7次。將表面消毒的根瘤放入含有0.3%剛果紅、Cu2+濃度為100 mg·kg-1、Pb2+濃度500 mg·kg-1、Cd2+濃度為50 mg·kg-1的YMA固體平板中，用無菌鑷子將根瘤夾破使汁液流出，然后進行涂布，28 ℃培養3～5 d。挑選表面濕潤光滑、邊緣整齊、呈現乳白色狀的單菌落進行多次劃線分離純化。用革蘭氏染色法染色，鏡檢。將純度合格的根瘤菌進行斜面和甘油管保藏，備用。

提取供試菌株的總DNA，利用通用上下游引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′、1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′進行PCR擴增。PCR產物委托南京金斯瑞生物科技有限公司測序。測序結果用BLAST軟件與GenBank中已知的16S rDNA序列進行比對分析。

參考李艷梅等[21]、東秀珠等[22]文獻，進行根瘤菌部分生理生化特征測定，包括碳源利用、3-酮基乳糖反應、精氨酸脫羧酶等反應和檸檬酸鹽利用等。產吲哚乙酸參考Gordon等[23]、Sheng等[24]的方法，鐵載體能力測定參考Schwyn等[25]的方法。ACC脫氨酶測定參考Penrose等[26]的方法，固氮反應測定采用Schatz等[27]的方法。

根瘤菌回接試驗采用無菌蛭石營養瓶進行種植。稱取40 g蛭石裝入罐頭瓶中，按照蛭石∶無氮營養液=1∶2.5加入無氮營養液，用透氣封口膜密封瓶口，121 ℃滅菌2 h。選取飽滿、大小基本一致的紫花苜蓿種子，先后用75%乙醇、3%NaClO溶液表面消毒，無菌去離子水清洗。撒在滅菌的瓊脂糖固體培養基(15 g·L-1)上，置于25 ℃避光發芽。將表面滅菌催芽的紫花苜蓿種子放入無菌蛭石營養瓶中，每瓶5顆，每瓶接種5 mL供試菌株菌懸液(108CFU·mL-1)，接等量無菌水處理作為對照，每個處理3個重復。待植株長出第1片真葉后，置于自然光照下進行培養，每隔4～5 d補充10 mL無氮營養液。種植50 d后收獲植株，測定并記錄紫花苜蓿株高、干重和根瘤數量。

1.3 盆栽試驗

盆栽試驗于2016年3-5月在南京農業大學牌樓實驗基地溫室中進行。將風干過篩土壤分裝，每盆裝土2.0 kg，種植前5 d澆水，以土壤充分吸水濕潤為宜。將供試菌株單菌落接種至裝有100 mL TY液體培養基的三角瓶中，28 ℃、200 r·min-1振蕩培養18 h后，6000 r·min-1離心5 min，收集菌體沉淀。用無菌水重懸沉淀制備成OD600為0.8(約108CFU·mL-1)的菌懸液。將紫花苜蓿、黑麥草和甜高粱種子按照2.1的方法進行表面消毒，浸潤在上述供試菌株菌懸液中4 h，對照組種子浸泡滅菌懸液(CK)。將處理好的種子播種于盆缽中，出苗后進行適當間苗，每盆留苗5株，再次分別接種20 mL供試菌株菌懸液和滅菌懸液，每組處理3個重復。生長過程中用去離子水澆灌，日常光照，溫度一般在18～25 ℃。90 d 后分別收獲植物地上部(莖葉)和根部，并取根際土壤風干待測。用去離子水沖洗3遍后于105 ℃下殺青，然后在75 ℃下烘干至恒重，測定干重，同時測定各植物樣品中Cu的含量。

1.4 土壤和植物樣品的分析方法

將植物樣品磨碎，地上部和根部樣品各稱取0.50和0.05 g，加入10 mL混合酸(HNO3-HClO4體積比為3∶1)，采用微波消解儀進行微波消解預處理，用ICP-AES(inductively coupled plasma-atomic emission spectrometer)測定植物中Cu含量。

土壤有效態Cu含量測定參照Maiz等[28]的方法。將風干后的根際土壤樣品過0.85 mm孔徑篩，稱取土壤樣品 4.000 g于離心管中，加入20 mL提取劑(diethylenetriaminepentaacetic acid, DTPA)，在25 ℃、200 r·min-1條件下振蕩2 h。浸提后的樣品在12000 r·min-1條件下離心10 min，過濾后用ICP-AES測定Cu含量。

在測定土壤和植物重金屬含量的基礎上，計算植物Cu富集系數和轉移系數。Cu富集系數=地上部Cu含量/土壤Cu含量。Cu轉移系數=地上部Cu含量/根部Cu含量。

參考鮑士旦《土壤農化分析》[29]中土壤酶活性測定，采用苯酚-次氯酸鈉比色法測定脲酶活性，于波長578 nm處比色，單位(以NH4+-N計)為mg·(g·h)-1。采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定蔗糖酶活性，于波長508 nm處比色，單位為mg·(g·h)-1。參考王學奎《植物生理生化實驗原理和技術》[30]，使用苯酚法測定土壤中水溶性糖含量。

1.5 數據處理

利用Excel 2010進行數據處理，用GraphPad Prism 5軟件作圖，用SPSS 20.0軟件進行數據統計分析，差異顯著性用配對樣本T檢驗和單因素分析中LSD方法檢驗。

2 結果與分析

2.1 供試菌株的篩選及鑒定

從紫花苜蓿根瘤中分離純化得到1株具有較強耐受重金屬Cu2+、Pb2+和Cd2+的菌株D10(表1)。該菌株能夠利用葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖和甘露醇為碳源，精氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶和賴氨酸脫羧酶陽性，利用檸檬酸鹽，3-酮基乳糖反應陰性。16S rDNA序列與GenBank 中SinorhizobiummelilotiLMG6133(T)的16S rDNA 序列相似性達到100%。本研究中將其命名為S.melilotiD10，16S rDNA序列登錄號為KX058129。

將菌株D10回接紫花苜蓿試驗結果表明，菌株D10能與紫花苜蓿共生結瘤，促進苜蓿生長。由表2可知，與接滅菌液對照相比，接種D10的紫花苜蓿株高顯著增加74.8%，根部和地上部干重分別顯著增加1.5和1.6倍(P<0.05)。對照組紫花苜蓿沒有檢測到根瘤，接種D10的紫花苜蓿根瘤數量達到33個·pot-1。

表1 菌株D10的生物學特性和重金屬耐性Table 1 Properties of metabolic property and heavy metals tolerance of strain D10

注：+表示陽性，-表示陰性。

Note: + indicate positive，- indicate negative.

表2 菌株D10對紫花苜蓿生長和結瘤的作用Table 2 Effect of strain D10 on the growth and nodulation of M. sativa

注：*表示T檢驗同一種植物中D10處理與CK有顯著差異，P<0.05。下同。

Note: * indicates significant difference between D10 treatment and CK at 5% level by T test. The same below.

2.2 菌株D10促進植物生長的作用

由圖1可知，在銅污染土壤生長的能源植物生物量差異表現為甜高粱>苜蓿>黑麥草，甜高粱的生物量可達到黑麥草的4.6～6.4倍，紫花苜蓿的生物量是黑麥草的1.2～2.4倍。菌株D10對供試植物的促生效果表現為苜蓿>甜高粱>黑麥草。與接滅菌液處理相比，接種D10的苜蓿根和地上部的干重分別顯著增加78.1%和72.2%(P<0.05)，甜高粱根和地上部干重分別顯著增加28.6%和39.3%(P<0.05)。D10對黑麥草幾乎無促生作用。結果表明，在銅污染土壤中D10菌株仍能有效促進苜蓿生長，也與甜高粱匹配促進植物生長。

圖1 銅污染土壤中菌株D10對能源植物生長的影響Fig.1 Effect of strain D10 on the biomass of the plants grown in the Cu-contaminated soil 不同小寫字母表示不同處理之間差異顯著(P<0.05)。下同。Different small letters are significant difference at P<0.05. The same below.

2.3 菌株D10促進植物吸收Cu的作用

由表3可知，3種植物Cu含量差異為甜高粱>黑麥草>紫花苜蓿，且植物根比地上部積累較多重金屬Cu。接種菌株D10處理后，苜蓿和甜高粱根部Cu含量比接滅菌液對照分別顯著增加18.4%和16.7%(P<0.05)。而菌株D10對3種植物的地上部Cu含量沒有影響。

表3 菌株D10對能源植物吸收銅的影響Table 3 Effect of strain D10 on the Cu content and uptake of the plants

甜高粱Cu總吸收量遠大于黑麥草和紫花苜蓿，由于甜高粱的地上部生物量遠大于黑麥草和紫花苜蓿，地上部Cu總量低于根部Cu總量。接種菌株D10處理后，苜蓿和甜高粱Cu總吸收量也顯著增加。與接滅菌液對照相比，D10處理的甜高粱根和地上部Cu吸收量分別顯著增加50.4%和50.8%(P<0.05)，苜蓿根和地上部Cu吸收量分別顯著增加111.8%和62.0%(P<0.05)，黑麥草根和地上部總吸收量變化不大。

甜高粱對Cu的轉移系數和富集系數也高于苜蓿和黑麥草。接種D10處理后黑麥草Cu轉移系數和富集系數沒有差異。D10處理的苜蓿、甜高粱根Cu富集系數顯著增加，但Cu轉移系數幾乎不變。結果表明，甜高粱比苜蓿和黑麥草富集較多的Cu，菌株D10能夠促進甜高粱和紫花苜蓿富集較多Cu。

2.4 菌株D10對植物根際土壤有效態Cu含量、水溶性糖含量、蔗糖酶和脲酶活性的影響

植物根際土壤中重金屬的生物有效性是制約植物提取效率的關鍵因素之一，而土壤中重金屬的存在形態決定了重金屬的生物利用率。由圖2可知，與接滅菌液對照(CK)相比，接種D10后植物根際有效態Cu含量比對照均有所增加，其中甜高粱和黑麥草根際有效態Cu含量比對照分別顯著增加29.0%和8.7%(P<0.05)，紫花苜蓿根際有效態Cu含量增加不顯著。土壤中水溶性糖類是1種重要的碳水化合物，是微生物和植物最重要的營養物質之一。供試植物根際水溶性糖含量差異為甜高粱>黑麥草>紫花苜蓿，接種D10后，甜高粱根際水溶性糖含量比對照顯著增加25.3%(P<0.05)，紫花苜蓿和黑麥草根際水溶性糖含量增加不顯著。

圖2 菌株D10對植物根際土壤有效態Cu含量、水溶性糖含量、蔗糖酶和脲酶活性的影響Fig.2 Effect of strain D10 on the contents of available Cu and water-dissolved carbohydrate, the activity of sucrase and urease in the rhizosphere soil of plants

指標Indexes(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)根Cu吸收量Cu uptake in root (1)10.994**0.587*0.907**0.971**0.952**-0.1760.899**-0.4170.475*地上部Cu吸收量Cu uptake in shoot (2)10.539*0.891**0.974**0.969**-0.1670.879**-0.4590.484*根Cu含量Cu content in root (3)10.811**0.4050.356-0.498*0.827**0.2740.002地上部Cu含量Cu content in shoot (4)10.820**0.772**-0.488*0.925**-0.2170.213根干重Root dry weight (5)10.984**-0.1070.801**-0.541*0.488*地上部干重Shoot dry weight (6)1-0.0210.784**-0.552*0.524*有效態Cu含量Available-Cu (7)1-0.276-0.0470.362水溶性糖含量Soluble sugar (8)1-0.1130.269蔗糖酶活性Sucrase activity (9)1-0.411脲酶活性Urease activity (10)1

注：*和**分別表示在 5%和1% 水平(雙側)上顯著相關。

Note: * and ** indicate significant difference at 5% and 1% level, respectively.

重金屬污染對土壤酶活性的影響多表現為抑制作用。接種D10后，黑麥草根際土壤中蔗糖酶活性比對照顯著增加39.3%(P<0.05)，紫花苜蓿和甜高粱根際蔗糖酶活性增加不顯著。接種D10處理的甜高粱根際土壤脲酶活性顯著增加21.1%(P<0.05)，紫花苜蓿根際脲酶活性增加不顯著，黑麥草根際脲酶活性反而有所下降。

由表4可知，植物根和地上部Cu吸收量與地上部Cu含量、干重和根際土壤水溶性糖含量極顯著正相關，并且與根Cu含量、根際土壤脲酶活性顯著正相關。植物根和地上部Cu含量與根際土壤中水溶性糖含量極顯著正相關(P<0.01)，與有效態Cu含量顯著負相關，而且植物地上部Cu含量與植物干重極顯著正相關。植物根和地上部干重與根際土壤水溶性糖含量極顯著正相關，與土壤脲酶活性顯著正相關，與根際蔗糖酶活性顯著負相關。植物根際有效態Cu含量與土壤酶活性和水溶性糖含量之間沒有相關性。

3 討論

3.1 耐重金屬根瘤菌的篩選

多年生豆科牧草紫花苜蓿適應范圍廣、抗逆性強，作為生物能源的開發利用在國內外已經有不少研究[6]。如果有合適的根瘤菌與其共生結瘤固氮，可以大大減少紫花苜蓿的用肥量，降低其在邊際土壤上的種植管理成本。因此，本研究從生長在重金屬污染土壤上的紫花苜蓿根瘤中，分離篩選耐重金屬的共生根瘤菌，有利于建立良好的共生固氮關系。研究結果表明篩選獲得的S.melilotiD10菌株能夠回接紫花苜蓿共生結瘤，在銅礦廢棄地土壤上，S.melilotiD10菌株也能顯著促進紫花苜蓿生長和富集銅。Fan等[31]從生長于中國西北某尾礦上的天藍苜蓿根瘤中分離到耐Cu根瘤菌S.melilotiCCNWSX00200，Lu等[32]進行了在Cu或Zn脅迫下該菌株的轉錄組學分析，發現細菌銅抗性相關基因通過直接或間接方式影響根瘤形成，從而影響修復效率。根瘤菌與豆科植物品種間的不同共生組合，其固氮效果差異較大，這種差異由根瘤菌菌株和植物品種雙方基因的相容性所決定，并涉及宿主植物、根瘤菌和環境間復雜的互作[33-34]。因此，S.melilotiD10菌株與紫花苜蓿的共生作用是否能夠應用于其他土壤環境，還需要進行多品種、多地的應用研究，并闡明其互作機理。

3.2 不同能源植物對重金屬的富集作用

紫花苜蓿、多年生黑麥草和甜高粱是當前能源植物的首選，在礦區廢棄地上的種植也有應用，但不同植物在重金屬污染土壤上的生長和富集重金屬能力具有差異。馮鵬等[35]的研究結果表明多年生黑麥草根系生物量大，對輕度Pb、Cd污染土壤修復效果更為明顯。De Gregori等[36]發現苜蓿可以積累較高濃度的Cu(19～126 mg·kg-1)和As(5.7～16.3 mg·kg-1)。Jia等[37]分析了96個基因型甜高粱對Cd的吸收作用，發現甜高粱的莖Cd含量范圍為19.0～202.4 mg·kg-1，根中Cd含量277.0～898.3 mg·kg-1不等，而且甜高粱根生物量可以反映該植物對Cd的富集能力。本研究中在銅礦廢棄地土壤上甜高粱生物量達到1.1 ～5.7 g·pot-1，對銅的富集量可達503.8～589.3 μg·pot-1，遠大于紫花苜蓿和黑麥草。由此可知，大生物量植物甜高粱對重金屬提取效果較好。

3.3 根瘤菌強化能源植物富集重金屬的作用

根瘤菌作為特殊的植物促生細菌，能夠與豆科植物共生、結瘤、固氮，還可以產生吲哚乙酸和鐵載體等促生物質促進植物生長、提高植物對重金屬的耐受性，而植物能夠為附生的微生物提供生長所需的空間和養分[38-40]。在銅礦廢棄地土壤上S.melilotiD10菌株能夠顯著促進紫花苜蓿生長，因為S.melilotiD10菌株與紫花苜蓿建立了良好的共生關系，結瘤固氮促進苜蓿生長。黑麥草和甜高粱都是禾本科草本植物，D10可以促進甜高粱的生長，但對黑麥草的促生作用不顯著。菌株對其有促生作用，很可能是分泌植物激素等原因。此外，水溶性糖作為土壤有機質成分，是根際微生物和植物能夠直接或快速利用的碳源和能源，也是根系分泌物的一種，可以影響土壤重金屬的生物有效性和吸附解吸過程，還能與根際微生物相互影響[41]。本研究中甜高粱根際水溶性糖含量高于黑麥草，S.melilotiD10菌株可以顯著提高甜高粱根際水溶性糖含量，而且植物根際水溶性糖含量與植物干重、Cu含量和總量極顯著正相關，與陳生濤等[42]的研究結果相似，說明D10菌株與甜高粱相互適應，水溶性糖含量的增加有助于甜高粱生長和吸收富集Cu。

土壤酶是土壤有機體的代謝動力，對環境因素的變化較敏感，其中脲酶活性對土壤Cu污染最為敏感，蔗糖酶其次[43]。本研究中植物根際脲酶活性與植物干重、Cu總量顯著正相關，推測接菌處理提高土壤酶活性，緩解Cu污染對土壤酶活性的抑制作用，從而促進植物生長和富集Cu。

本研究中供試能源植物根系豐富，而盆栽試驗容器較小，土壤受植物根系和接種D10影響較大，D10菌株能夠改善能源植物根際土壤有效態Cu含量、水溶性糖含量和土壤脲酶活性，促進能源植物生長和富集Cu。進一步開展能源植物根際環境中重金屬-根系分泌物-根瘤菌相互作用研究，將深化污染土壤植物修復領域的機理性認識。另外，在實際應用中也要充分考慮根際效應和菌株與植物的匹配關系，探討根瘤菌強化能源植物修復重金屬污染土壤的規模化應用效果。

4 結論

從紫花苜蓿根瘤中分離篩選到耐銅鉛鎘的苜蓿中華根瘤菌(S.meliloti)D10菌株。在銅礦廢棄地土壤上，D10菌株能夠促進紫花苜蓿和甜高粱生長，增加紫花苜蓿和甜高粱根對Cu的吸收，尤其是甜高粱對Cu的總富集量顯著增加。D10菌株能夠改善能源植物根際土壤有效態Cu含量、水溶性糖含量和土壤脲酶活性，促進能源植物生長和富集Cu，具有應用于銅礦廢棄地植被恢復和聯合修復污染土壤的潛力。