拉曼光譜技術在藥物晶型研究中應用進展*

周健，楊世穎，靳桂民，張麗，呂揚

(北京協和醫學院中國醫學科學院藥物研究所晶型藥物研究北京市重點實驗室，北京 100050)

拉曼光譜法是基于拉曼散射原理[1]的分子振動光譜，是研究化合物分子受到光照射后所產生的散射光、入射光的能級差與化合物振動頻率、轉動頻率相互關系的分析方法，通過測量拉曼散射光中特定譜成分的相對強弱，可以獲得被測分子或者體系的相關信息[2-3]。拉曼光譜技術以其自身在物質定性和定量分析中所顯示出的優越性，被廣泛應用于藥物、食品、化學、生物等多個領域[4-5]。在藥物研究領域，拉曼光譜可用于單一組分的化合物的定性鑒別，也可用于中藥材或藥物制劑等復雜成分的定性或定量研究[6-10]。拉曼光譜結合多種化學計量法可用于表征未知化合物，確定其成分并獲得有關其結構的信息，也可實現定量分析目的[11-13]。此外，拉曼光譜在藥物動態過程變化的研究中也有較多應用，如利用拉曼光譜了解藥物溶出過程中早期變化[14]；作為過程分析技術的研究工具，用于在線測定藥物活性成分的濃度和聚合物-藥物在藥物熱熔出過程中的變化[15]。拉曼光譜技術在藥物逆向工程[16]的研究中也發揮著重要的作用。

近年來，隨著科研人員對拉曼光譜認識的深入以及拉曼光譜儀器發展的進步(分辨率提高等)，拉曼光譜越來越多地應用于藥物不同晶型物質間細微差別的區分[17]。《歐洲藥典》[18]、《英國藥典》[19]、《中華人民共和國藥典》[20]均已將拉曼光譜技術列為藥物晶型研究常用的檢測分析方法。在藥物晶型研究的常用檢測分析方法中，僅有單晶X射線衍射分析可以提供晶型物質全面的定性定量信息，但由于該方法需要得到滿足衍射實驗的單晶體，從而使得其在應用上受到一定限制。更多情況下，晶型研究需要采用多種分析方法從不同角度與不同層面共同表征，如粉末X射線衍射方法提供晶型物質的分子排列規律信息，熱分析方法給出不同晶型物質的熱力學差異與含有結晶水或結晶溶劑等情況，光譜方法則通過反映分子基團的振動差異而在不同晶型物質間的分子作用力分析方面具有更多優勢。作為一種光譜學方法，拉曼光譜技術在藥物的多晶型研究方面具有獨特的優勢，具體表現在：①拉曼是物質的指紋光譜[21]，拉曼光譜技術以其自身特有的拉曼信號響應，定性角度可以得到物質結構、晶型等信息；②雖然拉曼光譜與紅外光譜一樣，反映化合物分子結構中基團的振動信息，但紅外光譜源于分子偶極距變化，拉曼光譜則由分子極化率變化產生。因此，紅外吸收弱的峰在拉曼光譜中很強，可以與紅外光譜形成有力互補；③拉曼光譜在檢測低頻振動方面具有優越性，甚至可檢測到分子的晶格振動；④拉曼光譜譜帶的強度與待測物濃度的關系遵守朗伯-比爾定律，可以通過光譜校正得到濃度的分布，為藥物晶型定量分析提供可行方法；⑤基于拉曼成像技術的原理，同時將共聚焦顯微技術與激光拉曼技術相結合，即時的圖譜結果可通過多種數學運算轉換為樣品組分圖像[16]，這一技術優勢也為運用拉曼光譜技術進行多晶型組分定量研究，特別是對于制劑中晶型問題的研究奠定基礎；⑥拉曼光譜技術無需樣品制備，屬對樣品無損的原位檢測技術。鑒于這些獨特的優勢，拉曼光譜在藥物晶型的研究中日益受到廣泛關注和應用[16，22-24]。筆者在本文聚焦拉曼光譜技術在藥物晶型研究中的應用，對國內外相關文獻進行歸納與總結，系統綜述拉曼光譜在藥物晶型定性、定量、動態過程研究中的進展，旨在為相關領域研究人員提供思路與參考。

1 拉曼光譜用于藥物晶型定性研究

藥物的不同晶型物質之間具有相同的化合物結構，但是不同晶型物質中藥物分子具有不同的分子排列規律、分子構型構象或不同的結晶溶劑種類與數量，由此具有不同的分子內或分子間作用力，這些晶型間的差異反映在拉曼光譜中，往往體現在圖譜的峰數量或峰裂分、峰位置以及峰強度或峰形拓撲等方面。

楊梁等[25]在對鹽酸林可霉素兩種晶型進行單晶X衍射分析的基礎上，開展該兩種晶型中不同的分子構象對兩種單晶拉曼光譜行為影響的研究。通過對比分析可發現，林可霉素兩種晶型的拉曼光譜圖譜存在的主要區別在于，晶型Ⅰ在1667 cm-1處有1個明銳的的散射峰；晶型Ⅱ在相同的位置則分裂為1687 cm-1和1667 cm-1處的2個毗鄰相連的散射峰；晶型Ⅰ在1151 cm-1和1143 cm-1處頂部分裂為2個散射峰；晶型Ⅱ在1146 cm-1處的散射峰則為頂部形成平臺的單峰。該實驗結果證明不同晶型在拉曼圖譜中特征峰的裂分行為也可以作為定性區分的依據。同時實驗結果表明，在已知單晶結構的基礎上，拉曼光譜給出的信息可以更準確地確定分子結構中相關特征基團及晶體結構中氫鍵的振動信息。

拉米夫定(lamivudine) 是臨床上用于治療乙型肝炎和艾滋病的核苷類藥物，據文獻報道，拉米夫定有兩種晶型，晶型Ⅱ流動性好，且在水中的溶解度高于晶型Ⅰ，為藥用晶型。葉曉霞等[22]以拉米夫定中的雜質晶型——晶型Ⅰ為分析目標，探討晶型藥物中雜質晶型的定量測定方法的過程中，通過拉曼光譜對拉米夫定的兩種晶型進行有效的區分。通過拉曼圖譜的對比分析，發現在掃描范圍3500～200 cm-1內，晶型Ⅰ在697和312 cm-1有明顯的散射峰，晶型Ⅱ在916和851 cm-1有明顯的散射峰。在利用拉曼光譜對拉米夫定的兩種晶型進行定性區分的實驗中，兩種晶型特征峰位置的不同成為定性鑒別的主要依據。

尼莫地平是臨床應用廣泛的鈣通道阻滯劑類降壓藥。焦凌泰等[26]通過快速去溶劑法制備尼莫地平A、B兩種晶型。對兩種晶型的樣品進行拉曼光譜分析。對得到的拉曼圖譜進行分析比較，發現兩種晶型樣品在4000～200 cm-1內，主要區別在于2種晶型在部分峰強度上存在差異，其中在1352 cm-1處主強峰和1645 cm-1處的次強峰的峰強度之比，晶A型兩個強峰強度之比為10 192：10 174，晶B型的強峰比次強峰峰強度之比為8274：6411。根據峰強度不同，可有效鑒別尼莫地平兩種晶型。

拉曼光譜技術除了對原料藥的不同晶型實現定性研究，也可用于對片劑中藥物活性成分的不同晶型進行定性研究。西尼地平是一種新型二氫吡啶(dihydropyridine，DHP)類鈣通道拮抗藥，具有長時間持續擴張血管的作用。石云峰等[27]對制得的西尼地平α和β兩種晶型進行拉曼光譜檢測，通過觀察圖譜可發現西尼地平α晶型和β晶型的拉曼峰有差異。此外，通過隨機取點進行面和深度掃描，對三家企業的市售西尼地平片和原研企業的西尼地平片進行拉曼光譜檢測，初步判定四種片劑中西尼地平存在的晶型狀態。

楊偉峰等[28]通過拉曼光譜技術對硫酸氫氯吡格雷原料藥和對照品進行表征，并得到兩種晶型的拉曼對照圖譜。隨后通過拉曼光譜對來自11個廠家的硫酸氫氯吡格雷片進行表征，用OPUS軟件聚類分析法判別出國內外不同廠家硫酸氫氯吡格雷片的晶型，再通過建立定性鑒別模型鑒別未知樣品。聚類分析結果表明8批硫酸氫氯吡格雷片均屬于晶型Ⅰ，3批硫酸氫氯吡格雷片均屬于晶型Ⅱ，采用一階導數法和矢量歸一化法處理圖譜，用因子分析法計算，選擇500～743、900～1000、1400～1650 cm-1譜段建立定性模型，經驗證，該模型的靈敏度、專屬性、陰性預報性和檢出效率均良好。石云峰等[29]采用相似的方法對卡馬西平4種晶型，進行拉曼光譜表征，并建立定性鑒別模型，對4批卡馬西平片劑中晶型種類實現的檢測。

除了上述利用拉曼光譜技術對片劑中藥物活性成分的不同晶型進行定性研究，拉曼光譜也可以用來對藥物中API的晶態和無定形實現定性檢測。NAKAMOTO等[30]選用乙琥胺(ESM)被選作模型制劑的API。固態乙琥胺通過加熱熔化和吸附在水合二氧化硅上來實現從晶態到無定形的轉變。將這一過程作為模型，通過拉曼微光譜的對樣品中晶態和無定形的分布完成檢測。實驗結果表明，拉曼光譜特征峰值的差異可用來確認兩種形式的乙琥胺，同時還證實拉曼微光譜可用于在固體制劑表面表征晶態和無定形。

2 拉曼光譜用于藥物晶型定量研究

近年來，隨著拉曼光譜技術的探索不斷深入，拉曼光譜在藥物晶型中的應用也從定性鑒別逐步擴大到多元晶型混合物定量研究。利用拉曼光譜對多元晶型混合物進行定量，主要通過建立標準曲線及結合化學計量學方法進行。

墨玉欣[31]通過標準曲線建立的方法，利用在線拉曼光譜技術對L-谷氨酸水溶液及兩種混合晶型的懸濁液實現定量分析。將兩種晶型物質采用等量倍增法混勻，制成分別含晶型Ⅰ 0%，5%，10%，30%，50%，75%，90%和100%的線性混合物。分別測定線性混合物的拉曼光譜，以強度比值為縱坐標，濃度C為橫坐標，進行線性回歸，得線性方程。

拉曼光譜結合多種化學計量學的方法可以對研究對象實現較好的定量研究，常用的方法包括主成分分析(PCA)，聚類分析，直接經典最小二乘法(DCLS)和多變量分析曲線分辨率(MCR)等[32-34]。在對多元晶型混合物的定量中，偏最小二乘法(PLS)和主成分回歸(PCR)分析法的應用最為廣泛。STRACHAN等[35]和MARCO等[36]均以卡馬西平為例，對其多晶型混合物進行定量分析。前者利用拉曼光譜結合PLS和PCR對卡馬西平多晶型混合物進行定量分析，研究結果表明，拉曼光譜數據的PLS和PCR為多晶型的定量分析提供一種靈敏的方法，LD通常<1%。后者則利用拉曼光譜結合PLS完成了對卡馬西平三元晶型混合物的定量檢測，使用平均光譜來建立校準模型，并使用額外的樣品組來評估模型，PLS模型給出預測的均方根誤差為6.2%。LI等[37]對磺胺甲嘧啶(SMZ)二元多晶型混合物中的雜質晶型進行定量測定，運用PLS回歸來對收集到的SMZ兩種晶型混合物的拉曼光譜建立標準校正模型。HU等[38]通過使用拉曼光譜聯合衰減全反射-紅外光譜(ATR-IR)和近紅外光譜(NIR)，并結合PLS完成了對磺胺噻唑3種晶型混合物的定量分析。KACHRIMANIS等[39]通過拉曼光譜結合PLS回歸分析方法對撲熱息痛的多晶型混合物實現了定量，特別要提到的是，該實驗采用3種不同的預處理算法，即正交信號校正(OSC)，標準正常變量變換(SNV)和乘法散射校正(MSC)以消除由樣品制備和樣品不均勻性引起的影響。實驗發現經過OSC算法預處理后得到的光譜，可以得到具有出色預測性能且更為簡單的PLS模型。NéMET等[40]利用拉曼光譜技術結合經典最小二乘(CLS)，主成分回歸(PCR)和PLS法在不同光譜范圍下，通過不同路徑長度類型和光譜預處理步驟對法莫替丁的多晶型混合物進行了測試，同時還對比在該項檢測中拉曼光譜技術相較PXRD所表現出來的優勢。

利用拉曼光譜結合化學計量法作為研究手段，LIPIAINEN等[41]采用吡羅昔康作為研究對象，對比低頻和中頻拉曼光譜在藥物晶型定量中的檢測能力。吡羅昔康多晶型和水合物在低頻和中頻區域中都顯示出明顯的光譜差異。在低頻和中頻拉曼光譜中，兩個特征區域都提供了適合結合PLS來預測混合物組成的定量模型。實驗結果表明，低頻數據給出更好的定量模型，低頻拉曼分析的更好性能歸因于固態形式之間較大的光譜差異和較高的信噪比。

除了可以開展對混晶物質的晶型定量研究外，拉曼光譜技術也可以用于對制劑中藥物活性成分的晶型定量。阿托伐他汀鈣(atorvastatin calcium，ATC)是最暢銷的降脂制劑Lipitor?的活性藥物成分(active pharmaceutical ingredient，API)。據報道ATC現存在12種晶型。SKORDA等[42]利用拉曼光譜技術對ATC片劑中晶型Ⅷ進行定量，選擇1602 cm-1作為合適片劑ATC峰值，對于賦形劑使用359 cm-1。實驗發現，與紅外光譜和X射線粉末衍射定量相比，拉曼光譜表現出更低的檢測限，并構建標準模型。HENNIGAN等[43]通過拉曼光譜技術結合化學計量法，并通過了MSC和Savitzky-Golay二階導數組合的方法對光譜圖進行預處理，最后成功對吡拉西坦片劑中雜質晶型的含量實現測定。PRATIWI等[44]將拉曼光譜的主成分分析方法(PCA)應用于兩種多晶型物質所組成的二元混合物的定量檢測中。實驗以鹽酸雷尼替丁的晶型Ⅰ和晶型Ⅱ為研究對象，通過將一種晶型添加到另一種晶型的粉末片劑中而制備二元混合物。再通過多元線性回歸預測二元混合物中兩種晶型的定量限和檢測限來建立定量校準模型。研究表明拉曼光譜數據的PCA分析為定量分析商品片劑中藥物多晶型雜質，提供一種靈敏的方法。

3 拉曼光譜用于藥物晶型動態過程分析

在藥物晶型問題的研究中，拉曼光譜除了可對藥物晶型進行定性與定量分析，利用其分析藥物晶型的動態過程問題也成為時下研究的一大熱點。一方面拉曼光譜是研究晶型動態轉化的有力手段，另一方面在過程控制中該項技術有應用優勢。在科研與生產中常用到的藥物晶型動態過程分析的方法主要有[45]：在線紅外技術、在線太赫茲技術、在線粉末X射線衍射技術以及熱臺偏光顯微鏡等。而拉曼光譜技術在其中受到大家廣泛關注，主要在于大多數有機物都具備很好的拉曼吸收光譜，拉曼光譜適用于水溶液體系，分辨率更高。但是應用拉曼光譜技術在對藥物晶型動態過程進行研究的時候，會出現由于溶劑的拉曼散射很強，很難從光譜數據中得出原料藥的拉曼光譜等問題。這也提示在研究過程中應注意對方法進行合理的調整[45]。

在利用拉曼光譜對晶型轉變過程的動態研究的實踐中，張慧麗等[46]利用拉曼光譜技術完成了對拉米夫定水合晶型在加熱過程中因失水而導致晶型轉變的動態特性研究，選取在(91±1)℃下對拉米夫定水合晶型的加熱脫水過程進行研究。對得到的拉曼光譜圖進行分析，得到特征峰面積隨時間變化的關系，結果表明在加熱過程中水合晶型的消失與無水晶型的形成的速率保持一致。TIAN等[47]利用拉曼光譜技術，對水性環境下卡馬西平3種晶型和晶Ⅰ、晶Ⅲ型混合物轉化為二水合物過程中的轉化動力學進行表征。樣品在(23±1)℃下分散在水中，并在10～210 min于不同時間點下進行回收。利用拉曼光譜結合定量模型得到的結果表明，水性環境下卡馬西平多晶型向二水合物的轉化。上述兩例均為應用拉曼光譜技術研究藥物晶型轉變的過程動力學問題提供參考依據。

拉曼光譜技術較多應用于在線過程分析。結晶工藝是藥物分離與精制的關鍵技術[45]，過程分析技術對于藥物結晶過程的分析與控制提供了巨大的幫助。利用在線拉曼技術對藥物的結晶進行過程控制，也以其自身的優勢受到日益廣泛的應用。由于水分的紅外吸收強，而拉曼吸收弱，因此拉曼光譜適用于檢測溶液結晶的過程。HU等[48]利用在線拉曼技術對氟滅酸多晶型的轉晶溫度進行測定。

4 結束語

值得注意的是，拉曼光譜技術在藥物晶型研究中，除了上述優點和適用性，也存在一些固有的缺點。①對于不同的晶型藥物品種，拉曼光譜并非全部特征有效，即便不同晶型物質間的拉曼光譜存在差異，這種差異也有可能十分微小。如曹俊姿等[49]在對左炔諾孕酮進行優勢藥用晶型研究的過程中，發現左炔諾孕酮3種晶型的拉曼光譜圖譜基本相似，無法對其進行明顯區分；張倩芝[50]在對治療十二指腸潰瘍藥物艾普拉唑的兩種晶型進行拉曼測試后，發現兩者拉曼光譜圖差異較小，建議應結合紅外光譜對兩種晶型進行鑒別。當藥物不同晶型的拉曼光譜差異較小時，嘗試可以達到更高分辨率的儀器或測試條件是行之有效的方法。②熒光效應的產生是利用拉曼光譜對藥物晶型進行研究時一個重要的干擾因素，對于棉酚等容易產生強烈熒光背底的物質，需要合理選擇激光波長進行晶型行分析[18]。因此，當采用拉曼光譜對藥物晶型進行定性研究，品種的特異性、儀器的分辨率以及測試條件的選擇往往是決定拉曼光譜是否能夠實現有效檢測的重要因素。

雖然拉曼光譜技術仍然具有一定的局限性，但在藥物晶型問題的研究上還是表現出巨大的潛力，為藥物晶型問題的研究提供更為廣闊的思路和角度。特別是隨著人們對于拉曼技術認識的加深，多種類型拉曼光譜儀的問世，在線拉曼光譜技術的逐步成熟，相信拉曼光譜技術會在該領域發揮出越來越重要的作用。