布魯氏桿菌病檢測方法的對比試驗

郭田順 袁梟龍 丁 勇*

1.河北省張家口市動物疫病預防控制中心，河北張家口075000；2.河北省懷安縣農業農村局，河北懷安076150

布魯氏桿菌病是一種人畜共患病，近年來，在牛、羊中流行呈增長趨勢，布病是急性傳染病，也是職業病，布魯氏桿菌為細小的球桿菌，革蘭氏染色陰性。布魯氏桿菌的實驗室診斷方式最常用的有：

1）平板凝集虎紅試驗（虎紅平板凝集試驗）：操作簡單快速、價格便宜。

2）試管沉淀，試管凝集試驗（確診方法）：血清凝集滴度（價）在1∶50以上為陽性，l∶25 為可疑，可疑多在3～4 周后采血重檢。如仍為可疑，則列為陽性。操作相對復雜、方法繁瑣費事、反應時間長。

3）布魯氏桿菌的試紙條（膠體金試紙條）：快速反應診斷，這是近幾年出現的快速診斷方法。

4）ELISA：簡單、快速、敏感性高、特異性高、結果易于判定、易于標準化、可實現高通量檢測。但需要時間長，一般不采用本方法。

為了準確診斷本病，筆者做了許多對比試驗（6 538 頭奶牛和1 368 只羊）。

1 材料與方法

1.1 試劑

虎紅凝集布魯氏桿菌抗原、布魯氏桿菌陽性血清、試管沉淀凝集布魯氏桿菌抗原（與陽性抗原）、布魯氏桿菌快速反應試紙條，布魯氏桿菌ELISA試劑反應盒。

1.2 方法

平板凝集試驗、試管凝集試驗、快速反應試紙條、布魯氏桿菌ELISA 試劑反應盒（結果對比與分析）。

1）平板凝集試驗（包括玻璃片或特制塑料平板或紙質一側加塑料膜的反應板）：取奶牛血清滴1 滴于反應板上，再加入1 滴虎紅凝集抗原用牙簽或火柴攪拌均勻，3～5 min 開始觀察，觀察結果共計6 538例，出現假陰性6例，陽性12例，可疑（即**或*凝集度）32 份。

2）布魯氏桿菌抗體快速檢測卡具有方便、快速、靈敏度高等特點，缺點是價格貴，增加養殖成本，適用于現場大批量樣品檢測，包括快速檢測卡、滴管、稀釋液，取出檢測卡，開啟后平放于操作臺上，將待檢樣品滴入點樣孔，再加2 滴樣品稀釋液于樣品孔中，加樣5 min 后，觀察顯色區，陰性為C 線顯色，T線不顯色，陽性為C 線顯色，T 線肉眼觀察，無論顏色深淺均判陽性，無效為C 線不顯色，T 線無論顯色或不顯色，都判無效。注意檢測卡開啟后，1 h 內必須使用，不能重復使用，滴加稀釋液后30 s 內，在顯色區無液體移動再補滴1 滴稀釋液。檢查結果較精準，結果：38 份陽性，12 份可疑，反復做2 次結果相同。

3）試管凝集試驗法或96 孔反應板凝集試驗法（可參照雞ND96 孔凝集反應）：將分離出的被檢血清用PBS液作連續倍比稀釋，加入1 滴試管凝集抗原，放置在一定室溫和一定時間觀察各種稀釋度的凝集效價。

具體操作為：①取小試管9 只排列于試管架上，自左至右順序為1～9 號；②于第1 管內加PBS液0.9 mL，從2～9 只試管各加入PBS 液0.5 mL；③用移液管吸取被檢血清0.1 mL，加在第1 只試管內混和均勻后，吸出0.5 mL，加入第3 只試管，如此連續稀釋至第7 只試管，混和均勻后吸出0.5 mL 棄去，第8 只試管加0.5 mL 1∶50稀釋的診斷血清，為陽性對照，第9 只試管加入PBS 液0.5 mL 為陰性對照。血清的稀釋順序為1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320 及1∶640；④于上述試管內，均加入試管凝集布魯氏桿菌病診斷液，搖晃震動試管架數分鐘，使反應液混和均勻；⑤將試管架放置37℃經18～24 h 觀察結果；⑥按反應強弱記錄結果，并用“-”、“±”、“+”、“++”、“+++”、“++++”作凝集程度的標記。“++++”全部凝集，上層液體透明。稱“100%”凝DN，“+++”明顯凝集，上層液體基本透明，或稱75%凝集；“++”上層液體較渾濁，但試管底可見凝集沉淀，或稱25%凝集；“+”可凝反應，“-”不凝集，陰性反應。出現陽性38 份，可疑12 份。

4）ELISA。酶聯反應是在免疫學的基礎上，利用抗原、抗體的特異性，其反應與酶對底物的高效催化作用相結合起來的一種敏感性很高的新技術。抗原與抗體的反應是在聚苯乙烯96 孔微量反應板內進行，每加入一種試劑作用后，經過多次洗滌除去多余的游離反應物，其特異性與穩定性得以保證。在試驗中主要有：間接法檢測抗體、夾心法檢測抗原的雙抗體以及競爭法檢測小分子抗原或半抗原的抗體等，比較常用的是夾心法與間接法。測定操作非常簡單，有標本的收集、保存、準備試劑、加樣、溫育、洗板、顯色、比色、結果報告和結果判斷及解釋等，每個步驟都要操作精細，如有不當都會影響測定結果，加樣、溫育和洗板3個步驟最重要。最為常用檢測樣品是血清（漿）、唾液（用于特定的檢測目的）、腦脊液、尿液、糞等。

具體操作步驟如下：

①包被（注意設置陰性對照、陽性對照和空白對照）。將使用抗原用包被稀釋液稀釋到使用濃度按照說明書用量來操作，置37℃培養箱培養4 h，或4℃放置24 h；將孔中液體甩掉棄去（板上加蓋或將板平放在底部有濕紗布的金屬濕盒中，其目的是防止水分快速蒸發）。

②酶標反應孔的封閉。用配制消毒好的5%健康小牛血清滴入孔內置37℃恒溫箱封閉40 min，封閉液加滿各反應孔，各孔中不要有氣泡出現，封閉結束后用洗滌液滿孔洗滌3 遍，每遍洗滌3 min。洗滌方法：吸干孔內反應液，將洗滌液注滿板孔，放置2 min 略作搖動，吸干孔內液，傾去液體后在吸水紙上拍干，洗滌次數3 次。

③加入待檢測樣品。檢測時一般采用1∶200的稀釋度，將稀釋好的樣品加入酶標反應孔中，每個樣品至少加雙孔，每孔100 μL，置于37℃恒溫箱40～60 min。用洗滌液滿孔洗滌3 遍，每遍3 min。

④加入酶標抗體。酶標抗體：根據酶結合物提供商提供的參考工作稀釋度進行，37℃，30～60 min（＜30 min 往往結果不穩定），每孔加100 μL，洗滌同前。

⑤加入底物液（現用現配）。首選TMB—過氧化氫尿素溶液，OPD—過氧化氫底物液系統次之。底物加入量：每孔100 μL，置37℃避光放置3～5 min，加入終止液顯色。

⑥終止反應。每孔加入終止液50μL，終止反應，于20 min 內測定試驗結果。

⑦結果判斷。OPD 顯色后采用492 nm 波長，TMB反應產物檢測需要450nm波長。檢測時一定要首先進行空白孔系統調零，用測定標本孔的吸收值與一組陰性標本測定孔平均值的比值（P/N）表示，當P/N＞2 時作為抗體的效價（數值的大小依具體檢測要求而定）。陽性46 份，可疑4 份。

3 結果分析

4種方法中，平板凝集是定性判斷，準確度略低；試管凝集是定量判斷，準確度較高，與近幾年紙片快速診斷相近，但準確度略低；紙片快速診斷是實驗室中診斷布魯氏桿菌病較準確的方法之一，為凈化布魯氏桿菌病提供了有力手段。

4 結語

近年來，隨著奶牛業發展，對布魯氏桿菌的凈化力度不夠，造成奶牛小區布病增多，其主要原因：一方面是經濟利益所致，只為數量，不要求質量；另一方面相關部門把關不夠。解決措施：①加強學習，讓人們了解本病的危害性，提高認識；②加大投入，對檢出病牛強制性撲殺；③提高凈化力度，做到應檢盡檢；④相關部門緊密配合，上下聯動打贏布病凈化攻堅戰。