肉雞MTHFD2基因的克隆和表達分析

魏 娟，戚 星，邢晉祎，徐 敏，孫煒涵

(臨沂大學生命科學學院，臨沂276000)

葉酸是指具有蝶酰谷氨酸結構的一類水溶性族維生素，普遍存在于各種動植物食品中，是人體和動物維持健康成長和發育的必需維生素之一。葉酸代謝途徑在細胞增殖中發揮重要作用，該途徑中所必需的酶一直是癌癥治療靶點的熱門研究對象，其中MTHFD2基因(Methylene tetrahydrofolate dehydrogenase 2，亞甲基四氫葉酸脫氫酶2)逐漸成為研究熱點。MTHFD2蛋白定位于線粒體，是一種雙功能酶，具有亞甲基脫氫酶和環化水解酶雙重活性，為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)依賴性酶，參與NADH的產生，能夠催化由亞甲基四氫葉酸和NAD+產生N-10-甲酰基-四氫葉酸和NADH的反應[1-2]。在快速生長的癌癥細胞中，MTHFD2蛋白是嘌呤合成中甲基鹽的主要來源[1-2]。 MTHFD2蛋白也是催化5，10-甲基-四氫葉酸和10-甲酰四氫葉酸相互轉化的酶[3]。人類MTHFD2基因被定位在2號染色體上[4]，雞MTHFD2基因被定位在22號染色體[5]。最新研究表明：MTHFD2基因的過表達與腫瘤細胞的增殖和乳腺癌的不良預后有關[1，6]，所以有學者提出把MTHFD2蛋白作為藥物開發的新靶標[1]。

雞作為模式生物在醫學研究領域已得到廣泛應用。本研究以肉雞為研究對象，克隆MTHFD2基因，并對其進行生物信息學分析，用定量PCR對其在不同組織的表達譜進行研究，旨在為進一步研究該基因的功能奠定基礎，也為預測某些癌癥疾病的發生和術后復發提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

M-MLV反轉錄酶(Promega公司)，UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]，EcoRⅠ和Hind Ⅲ限制性內切酶(NEB公司)，M-MLV反轉錄酶、Trizol Reagent和RNase Inhibitor(Invitrogen公司)，pMD19-T vector 、SYBR? Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)和LA Taq DNA聚合酶(Takara公司)。

1.2 實驗動物及樣品采集

試驗于2016年2—4月在臨沂大學山東省生物學實驗教學示范中心完成。隨機挑選5只42日齡愛拔益加(Arbor acres，AA)肉雞，屠宰前空腹12 h，可自由飲水。屠宰后采集肝臟、心臟、胸肌、腿肌、腎臟、脾臟、肺臟和腹脂，用磷酸緩沖鹽溶液(Phosphate buffer saline，PBS)沖去殘留血液，切割成0.5—1 g小塊，液氮速凍，-80 ℃保存備用。

1.3 試驗方法

1.3.1 組織總RNA的抽提和cDNA第一鏈的合成

組織總RNA提取采用Trizol法，按照Trizol試劑盒說明書進行。 cDNA第一鏈的合成利用M-MLV反轉錄酶合成，操作方法按照說明書進行。

1.3.2 引物設計和RT-PCR擴增

引物設計：根據GenBank上原雞MTHFD2基因(NM_001031360)序列，利用Primer Premier 6.0軟件設計引物MTHFD2-F和MTHFD2-R；根據測序得到的序列設計熒光定量PCR(qPCR)基因表達引物(Exp-F、Exp-R)；以管家基因β-actin(GenBank：NM_205518)為內參，設計引物β-actin-F和β-actin-R，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。

表1 PCR引物序列、退火溫度、擴增片段大小

PCR反應體系：在PCR管中加入1.0 μL模板cDNA(50 ng/μL)，2.5 μL 10×LA反應緩沖液，2.0 μL dNTP mix(每種2.5 mmol/L)，2.0 μL MgCl2(25 mmol/L)，0.4 μL MTHFD2-F(20 μmol/L)，0.4 μL MTHFD2-R(20 μmol/L)，0.2 μL(1 U)LA Taq DNA聚合酶，ddH2O補齊至25 μL，吹打混勻后稍離心片刻。反應程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 40 s，64 ℃ 40 s，72 ℃ 2 min，35個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

PCR產物檢測：配制1.2% 瓊脂糖，120V電泳檢測，用凝膠成像系統觀察并拍照。

1.3.3 克隆轉化與測序

上述PCR產物經瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化回收目的片段，純化產物與pMD19-T Vector于16 ℃連接30 min，連接產物轉化JM109感受態細胞，然后涂布于含有Amp、IPTG和X-gal的平板上培養過夜，挑取白斑菌落于3 mL LB培養基中 (含3 μL Amp)，37 ℃搖12—16 h。提取質粒，經EcoRⅠ和Hind Ⅲ酶切鑒定，至少挑取3個陽性克隆菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.3.4MTHFD2基因的生物信息學分析

將測序獲得的序列用DNAMAN軟件尋找開放閱讀框(Open read frame，ORF)，推測氨基酸序列，并比較與其他動物MTHFD2的氨基酸序列同源性；在NCBI網站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)上分析保守域等；用MEGA 5.05 軟件采用鄰近法構建進化樹。利用ExPASy(http：//www.expasy.org)分析蛋白質的基本理化性質、蛋白質疏水性、親水性、蛋白質的跨膜區和三級結構等。

1.4 利用定量PCR(qPCR)分析MTHFD2基因表達水平

采用SYBR Green I 染料法，進行qPCR分析，以雞管家基因β-actin為內參，分析MTHFD2基因在不同組織中的mRNA表達水平。

qPCR反應體系：10 μL SYBR? Premix Ex TaqTMII，1 μL cDNA(稀釋10倍)，0.2 μL Exp-F和0.2 μL Exp-R引物，滅菌超純水加至20 μL。qPCR反應程序：94 ℃ 2 min； 94 ℃ 10 s，57(55)℃ 10 s，72 ℃ 1 s，40個循環。每個循環后采集熒光生成擴增曲線。試驗對所有樣本進行3個重復測定，并在每次試驗時設陰性對照。根據熒光曲線的Ct值及標準曲線，以雞β-actin基因為內參，用2-△△ct法計算MTHFD2基因的相對表達量。

1.5 統計分析

采用SAS version 8.2 統計軟件對MTHFD2基因的相對表達量進行多重比較統計分析，結果用“平均值±標準誤”表示。當P<0.05時，差異達到顯著水平；當P<0.01時，差異達到極顯著水平。

1—3泳道為MTHFR2基因PCR產物；M：DL2000 DNA maker圖1 肉雞MTHFD2基因PCR產物Fig.1 PCR products of broiler MTHFD2

2 結果與分析

2.1 MTHFD2基因的克隆和序列分析

以42日齡肉雞肝臟cDNA為模板，用MTHFD2-F和MTHFD2-R引物擴增，經瓊脂糖凝膠電泳得到一條特異性帶(圖1)，測序后確認長度為1 554 bp，包含雞MTHFD2基因mRNA開放閱讀框(1 014 bp)和部分5’UTR(45 bp)、3’UTR(495 bp)序列，與GenBank上注冊的原雞序列(NM_001031360)有11 bp的差異，其中有10 bp的插入片段，該插入片段位于終止密碼子之后，所以不編碼氨基酸(圖2)。該序列編碼337個氨基酸(圖2)，氨基酸序列與其他物種比較結果見表2。從表2可見，雞與日本鵪鶉的氨基酸序列一致性最高，達到97.33%，與山羊的一致性最低。這些結果表明，MTHFD2蛋白在鳥類之間具有高度保守性。將氨基酸序列使用MEGA 5.05 軟件采用鄰近法構建分子進化樹，結果表明雞與日本鵪鶉聚為一類，進一步說明雞與日本鵪鶉的親緣關系較近(圖3)。

表2 雞和其他物種間MTHFD2氨基酸序列一致性比較

圖2 肉雞MTHFD2基因序列與GenBank注冊序列(NM_001031360)比對Fig.2 Alignment of MTHFD2 gene sequences between broiler and GenBank (NM_001031360)

注：0.02代表遺傳距離，每個節點的數字表示1 000次重復后的靴帶百分比圖3 MTHFD2蛋白系統發生樹Fig.3 Phylogenetic tree of MTHFD2

2.2 MTHFD2理化性質和結構預測

利用ExPASy(http：//www.expasy.org)分析結果表明，雞MTHFD2蛋白相對分子質量和等電點(PI)分別為36 411.44和9.51。雞MTHFD2氨基酸組成表明，丙氨酸占的比例最高(11.0%)，包含34個負電荷氨基酸殘基(天冬氨酸+谷氨酸)和44個正電荷氨基酸殘基(精氨酸+賴氨酸)。不穩定指數為25.86，屬于穩定蛋白；脂肪指數為 103.32，親水性平均系數為-0.066，屬于親水蛋白。用TMHMM程序對雞MTHFD2蛋白跨膜結構域進行分析，發現該蛋白位于胞外，不具備跨膜結構。利用SOPMA程序預測MTHFD2蛋白質二級結構表明，α-螺旋占31.16%，延伸鏈(即β-片層結構)占22.26%，β-轉角占9.2%，無規卷曲占37.39%，即主要以α-螺旋和無規則卷曲為主。 三級結構分析表明，以1b0a.1.A為模板，序列一致性為48.94%(圖4)。

2.3 MTHFD2基因組織表達譜分析

利用qPCR技術檢測MTHFD2基因在肉雞肝臟、脂肪、腎臟、脾臟、肺臟、心臟、胸肌和腿肌組織中的表達水平。結果發現：MTHFD2基因在所檢測的8種組織中均有表達，在腿肌中的表達水平最高，在肝臟中的表達水平最低，且在胸肌和腿肌中的表達水平極顯著高于其他組織(P<0.01)。

圖4 雞MTHFD2蛋白三級結構Fig.4 Chicken MTHFD2 protein three-dimensional model

圖5 雞MTHFD2基因的表達水平Fig.5 Expression levels of chicken MTHFD2

3 討論

在本研究中，從AA肉雞肝臟中克隆得到雞MTHFD2基因cDNA的部分序列(1 554bp)，所擴增的序列與GenBank上(NM_001031360)注冊的原雞核苷酸序列一致性為99.29%，氨基酸一致性為100%。值得注意的是，與GenBank上注冊的序列相比在終止密碼子之后發現有10bp的插入片段，這可能是MTHFD2基因的不同轉錄變異體，這個插入片段對MTHFD2基因的結構和功能以及雞的生長發育是否有影響，需要進一步研究。另外，試驗對MTHFD2基因在不同組織中的表達水平進行了分析，為進一步研究MTHFD2基因的功能奠定了基礎，也為葉酸代謝相關酶在疾病治療中提供參考。

目前，對MTHFD2基因功能的研究主要集中在人類癌癥方面。研究發現MTHFD2作為轉錄因子Nrf2的轉錄靶標，負責嘌呤的合成，可導致癌細胞的增殖[7]。MTHFD2蛋白在許多癌癥中表達水平均有顯著提高，并且與乳腺癌患者的低生存率相關[8]。Liu等[6]對乳腺癌患者組織切片進行蛋白印跡和免疫組化檢測，也發現了類似的結果，認為這種蛋白質可能是未來乳腺癌治療的獨立預后因素和潛在的治療靶點。劉新城等[9]報道肝癌組織中MTHFD2基因的表達水平顯著高于正常組織，且這種高表達與肝細胞癌轉移、復發有密切關系，由此預測MTHFD2基因可以作為預測肝癌患者預后的生物標志物。Hall等[10]發現MTHFD2基因編碼的酶參與甲硫氨酸循環相關的葉酸循環，甲硫氨酸循環又控制S-腺苷甲硫氨酸的量，人類胰島經過棕櫚酯處理后改變了S-腺苷甲硫氨酸水平，從而導致全基因組甲基化和CpG島甲基化水平改變，故MTHFD2基因表達可能影響甲基供體的量。本研究的組織表達譜顯示，MTHFD2基因在腿肌中表達水平最高，而在肝臟中的表達水平最低，表達水平的差異可能與動物品種有關。

盡管本試驗對肉雞MTHFD2基因部分序列進行了克隆和組織表達譜研究，但其功能還不是太明確，與葉酸代謝途徑中的其他代謝酶相比，例如MTHFR，目前對于MTHFD2基因的研究主要集中在人類疾病方面，對畜禽的研究才剛剛開始，所以，MTHFD2基因在不同物種中的確切功能及其作用機制和差異也不清楚，需要進一步探討。