土壤中的土霉素對蔗糖酶活性的影響

權(quán) 剛

(咸陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院,陜西 咸陽 721000)

在土壤中，有一類活性物質(zhì)，被稱為土壤酶，它是由部分微生物及動(dòng)植物的活體分泌物、殘?bào)w分解物、遺骸分解物等組成的，具有一定催化能力的活性物質(zhì)。它對促成土壤的發(fā)育熟化程度，提升土壤的肥力水平等方面都有重要的作用。土壤酶的種類繁多，根據(jù)其在土壤中的功能主要分為水解酶類、裂合酶類、氧化還原酶類和轉(zhuǎn)移酶類等四大類，它們各自在土壤發(fā)育過程中都有不同的作用。在水解酶類中，有一種能夠促進(jìn)土壤中的蔗糖通過水解作用形成葡萄糖和果糖的重要活性物質(zhì)，稱為蔗糖酶(亦稱轉(zhuǎn)化酶)。當(dāng)土壤中的有機(jī)質(zhì)、N、P等元素，和微生物數(shù)量增多時(shí)，土壤的呼吸強(qiáng)度亦隨之增強(qiáng)，同時(shí)，蔗糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖和果糖的轉(zhuǎn)化率也越高，蔗糖酶的活性也就越高。它的存在，主要是通過酶促轉(zhuǎn)化作用，將植物、微生物等體內(nèi)的蔗糖，轉(zhuǎn)化為葡萄糖，供其使用促進(jìn)自身生長。因此，土壤中蔗糖酶的含量及其活性，影響著土壤的熟化程度和肥力狀況，也是土壤狀況評價(jià)的重要因子。

抗生素的種類繁多，有一種四環(huán)素類抗生素，在我國畜禽養(yǎng)殖中被廣泛使用，主要用作飼料添加劑的抗菌藥物土霉素。動(dòng)物在生長過程中，攝入體內(nèi)的土霉素有20%會被身體吸收，剩余部分則通過糞尿等方式，被排出體外，而這些糞尿又通過腐殖質(zhì)肥料、漚肥等方式，作為肥料進(jìn)入農(nóng)田土壤，污染土壤生態(tài)環(huán)境。土霉素殘留在土壤中，并不能及時(shí)降解，會隨著時(shí)間的推移不斷累積，而種植在土壤上的各類農(nóng)作物及各類植物又會吸收一部分，最終由人類食用而進(jìn)入體內(nèi)，如果長期食用此類食物，會導(dǎo)致身體抗藥性增加，關(guān)鍵時(shí)刻藥物無法發(fā)揮效用。

目前國內(nèi)探索影響土壤環(huán)境生態(tài)的因素,更多關(guān)注的是重金屬、有機(jī)物、農(nóng)藥等，同時(shí)，還將它們作為生態(tài)毒理指標(biāo)之一，研究這些物質(zhì)在土壤中的殘留累積、污染情況，以及土壤生態(tài)環(huán)境的影響情況等內(nèi)容。而對于抗生素類藥物對土壤的污染，以及用土壤酶活性來評價(jià)土壤生態(tài)環(huán)境卻少有研究。

鑒于以上情況，試驗(yàn)設(shè)計(jì)在采樣土壤中，混入濃度遞增的的土霉素溶液，模擬土壤生長環(huán)境，進(jìn)行暗箱培養(yǎng)，并時(shí)定量補(bǔ)充土樣水分，通過提取、測定不同時(shí)期的土樣，并用葡萄糖含量來表示蔗糖酶的活性，對照空白分析對土壤蔗糖酶活性的影響，并以此為研究土壤生態(tài)環(huán)境污染提供參考。

1 試驗(yàn)材料與試驗(yàn)方法

1.1 試驗(yàn)材料材料

儀器設(shè)備：電熱恒溫培養(yǎng)箱、搖床振蕩器、離心機(jī)、電熱恒溫水浴鍋、756型紫外可見分光光度計(jì)等。供試材料：土霉素(Oxytetracycline Hydrochloride, OTC)，分子式：C22H24N2O9.HCl。分子量：496.90，純度98.9%。

試驗(yàn)用土采自咸陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院周邊村鎮(zhèn)(南北季村)，采用棋盤法取0～20 cm的耕層土壤。土壤采回后，將大塊壓碎，再過2 mm篩，篩后土樣室內(nèi)風(fēng)干后分裝編號。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 風(fēng)干土樣在試驗(yàn)之前，用蒸餾水調(diào)節(jié)土樣含水量，調(diào)至最大田間持水量的40%左右即可，裝入密封袋內(nèi)，模擬土壤生長環(huán)境，將土樣置于25℃的電熱恒溫培養(yǎng)箱中，暗箱培養(yǎng)一周，作為新鮮土樣備測。在供試新鮮土樣中加入濃度遞增的土霉素溶液，配制成含量為0、10 mg·kg-1、17.8 mg·kg-1、32.6 mg·kg-1、56.2 mg·kg-1、100 mg·kg-1(0、0.02、0.035、0.065、0.113、0.201 mol OTC·L-1)的試驗(yàn)用土。將各梯度濃度的試驗(yàn)用土稱取250 g，放置于500 mL的燒杯中，并在土壤樣品中滴入蒸餾水，調(diào)節(jié)土壤水分的含量，保持在最大持水量的50%，之后，將調(diào)節(jié)好的土壤樣品，放置于25℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行暗箱培養(yǎng)。培養(yǎng)期間，每周用重量差減法計(jì)算損失的水分，用蒸餾水補(bǔ)充土樣水分，并適當(dāng)通氣，保持土壤活性。測定時(shí)，分別取第3、7、14、21、28、56和112 d的土樣進(jìn)行測定，測定葡萄糖的含量。

1.2.2 測定方法 土樣處理：取出土樣充分混合后，采用四分法縮減，干燥、過篩進(jìn)行測定。

測定方法：采用水楊酸比色法。稱取5 g土樣，加入三角瓶中(容量50 mL)，向其中加入濃度為8%的蔗糖溶液15 mL，再滴入磷酸緩沖液5mL(pH5.5)和甲苯5滴，混合后置于搖床，充分搖勻后，于恒溫箱中在37℃下，培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)完成后，將土樣用離心進(jìn)行過濾，取上層濾液1mL置于容量瓶中(容量50 mL)，然后，向?yàn)V液中滴入還原劑3，5-二硝基水楊酸3 mL，置于恒溫水浴鍋中，100℃的恒溫加熱5 min，取出后用流動(dòng)的自來水將容量瓶冷卻3 min，用蒸餾水定容至50 mL，將比色皿在756型紫外可見分光光度計(jì)上于508 nm比色測定。

表示方法：蔗糖酶活性用24 h后土樣中葡萄糖的含量mg·g-1來表示。

1.2.3 抑制率的計(jì)算 抑制率即影響作用，表示土霉素對土壤蔗糖酶的影響。

抑制率大于零，表明土霉素的存在對土壤中蔗糖酶的活性具有促進(jìn)作用；抑制率小于零，則表明土霉素的存在對土壤對蔗糖酶的活性具有抑制作用。負(fù)號僅代表抑制，數(shù)值大小表明抑制的程度。

抑制率=(A-B)/A×l00%

式中：A—空白對照的土壤蔗糖酶活性

B—加入土霉素后的土壤蔗糖酶活性

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

按照上述測定方法，分別測定了第3、7、14、21、28、56、112天的土樣中葡萄糖含量，參照空白試驗(yàn)，結(jié)果表明：土樣中的土霉素濃度不同，測定出的葡萄糖含量也不同，表征的蔗糖酶的活性也不同。如圖1所示，在第3天時(shí)，處理過的土樣，其蔗糖酶活性與對照水平相同；在第7天到第56天中，蔗糖酶的活性均低于對照水平；直到第112天時(shí)，蔗糖酶的活性又回到對照土樣的水平。

圖1 蔗糖酶活性換算結(jié)果

按照抑制率的計(jì)算方法，分別計(jì)算了第3、7、14、21、28、56、112天的處理土樣對蔗糖酶的抑制率，如圖2所示。從圖2得出，在對土樣處理后，土霉素的濃度不同，培養(yǎng)時(shí)間不同，其抑制情況也不同。第3天的土樣測定結(jié)果顯示，蔗糖酶活性幾乎沒有受到影響；第7天的土樣測定結(jié)果顯示，蔗糖酶的活性受到了強(qiáng)烈的影響，表現(xiàn)為抑制，其濃度最小的土樣抑制率為33%，濃度最大的土樣抑制率為37%；在培養(yǎng)的第14天，抑制作用稍有下降，但隨著土霉素濃度增高，它對蔗糖酶活性抑制作用也越大，土霉素的濃度在56.2 mg·kg-1和100 mg·kg-1時(shí)，對蔗糖酶的活性影響較為強(qiáng)烈，表現(xiàn)為抑制作用，抑制率均為：20%；從第21天、第28天、第56天的測定結(jié)果可以看出，蔗糖酶的活性仍然受到了強(qiáng)烈的影響，表現(xiàn)為抑制作用；通過測定第112天的土樣，土霉素對蔗糖酶的活性影響較小，沒有表現(xiàn)出明顯的抑制作用，蔗糖酶的活性與第3天的水平相當(dāng)。甚至在低濃度的土樣中，土霉素對蔗糖酶的活性反而產(chǎn)生了促進(jìn)作用，蔗糖酶活性為3%；但高濃度的土樣中，土霉素對蔗糖酶的活性還是表現(xiàn)為較小的抑制作用。整體上看來，在對土樣暗箱培養(yǎng)7 d后，土霉素對蔗糖酶活性的影響，均表現(xiàn)為抑制作用，而且隨著時(shí)間增長，抑制作用一直存在，直到第112天時(shí)，土樣中的蔗糖酶活性才回到了初始對照水平。

圖2 蔗糖酶活性抑制率換算結(jié)果

試驗(yàn)表明，在培養(yǎng)的第7～56 d里，所有土樣中，不同濃度的土霉素都對土壤蔗糖酶的活性產(chǎn)生了影響，表現(xiàn)出明顯的抑制作用；直到第112天時(shí)，土樣中的蔗糖酶活性回到初始水平。由此可見土霉素對土壤中蔗糖酶的活性具有較大影響，這種影響與土霉素在土壤中殘留時(shí)間有關(guān)，而且作用時(shí)間是比較長的。

3 討論

通過對土壤進(jìn)行加工處理，添加不同濃度的土霉素，進(jìn)行暗箱培養(yǎng)，在不同的時(shí)間點(diǎn)測定土壤中蔗糖酶的活性。從試驗(yàn)數(shù)據(jù)以及對比空白分析，土霉素的存在確實(shí)對土壤蔗糖酶的活性有影響，在初期表現(xiàn)不明顯，從第7天開始，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，而且作用時(shí)間較長，直到第112天的時(shí)候，蔗糖酶的活性又回到了初始水平。

綜上所述，土壤中的土霉素確實(shí)對蔗糖酶的活性有影響，更多的為抑制作用。此外，土霉素的降解時(shí)間較長，很容易在土壤中累積，呼吁大家應(yīng)盡量減少抗生素類藥物的使用，改善土壤的生態(tài)環(huán)境。