不同施硒方式對水稻硒利用效率的影響*

張城銘 周鑫斌

（西南大學資源環境學院，重慶 400716）

硒（Se）是一種對人體健康至關重要的微量元素，主要以硒蛋白形式在體內發揮多種抗氧化功能，修復DNA損傷，提高免疫力，降低罹患癌癥的風險［1］。然而我國大約72%的土壤存在不同程度的缺硒或低硒，人均日硒攝入量為26.5 μg·d-1，部分地區甚至低于10 μg·d-1，達不到中國營養學會推薦的50～200 μg·d-1［2］，造成了潛在的健康風險。硒生物強化是一種將無機硒通過作物吸收代謝轉化為有機硒積累至可食部分的策略［3］。水稻是我國的主食，通過施用硒肥提高水稻籽粒硒含量對人們的健康具有重要意義。

水稻硒的農藝生物強化手段一般包括土壤施硒和葉面噴硒兩種方式。研究表明，以上兩種施硒方式均能有效提高水稻籽粒硒積累［4-5］，但其硒吸收轉運途徑卻不盡相同：土壤施硒一般經過三個階段，首先被水稻根部吸收，再轉運至地上部和葉中，最后再由葉分配至籽粒中［6-7］；葉面噴硒則由葉片直接轉運至籽粒。兩種不同施硒方式硒轉運途徑的不同對水稻籽粒硒生物強化效率影響是否存在差異，哪一種途徑效率更高尚不清楚，這嚴重制約著人們選擇合適的提高水稻籽粒硒含量的生物強化方法。此外，硒進入水稻根內之后很快代謝成多種含硒氨基酸［8］，硒和硫具有相似化學性質，硒甚至會取代一些含硫氨基酸中硫的位置，形成諸如硒代氨基酸等其他氨基酸和蛋白質［9］，可能對稻米營養品質有一定影響，但兩種施硒方式對稻米營養品質效應的比較研究尚未見報道。為此，本實驗在等量施硒的條件下，分別進行水稻葉面噴硒和土壤施硒，比較兩種不同施硒方式對水稻籽粒硒生物強化效應和營養品質的影響。這對于有效調控水稻籽粒硒生物強化，進而滿足人體硒營養健康具有重要的理論和實踐意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試水稻品種為重慶高產水稻宜香優2115。供試土壤采自重慶市北碚區西南大學紫色土基地，采用多點取樣法采集0～20 cm表層土，土壤類型為中生代侏羅系沙溪廟組灰棕紫色沙泥巖母質上發育的中性紫色水稻土（潛育水耕人為土），其基本理化性質如下：pH 6.5，有機質13.45 g·kg-1，堿解氮28.16 mg·kg-1，有效磷10.23 mg·kg-1，速效鉀101.2 mg·kg-1，有效硫3.10 mg·kg-1，全鐵29.1 g·kg-1，全鋁8.1 g·kg-1，全硒0.23 μg·kg-1，有效硒16.0 μg·kg-1，陽離子交換量18.5 cmol·kg-1。供試土壤經自然風干后磨碎過1 mm篩，充分混勻用于盆栽試驗。

1.2 試驗方法

試驗在西南大學資源環境學院植物營養學植物培養室內進行（白天光照時間14 h，光強度260～350 μmol·m-2·s-1，白天溫度28℃，夜晚溫度20℃，相對濕度60%～70%）。采用盆栽試驗，聚乙烯塑料盆尺寸為直徑30 cm、高50 cm，每盆裝入供試土壤5.26 kg，與基肥（N 0.15 g·kg-1，P2O50.1 g·kg-1，K2O 0.15 g·kg-1，分別以尿素、KH2PO4和KCl作為肥源）反復混勻，試驗期間加去離子水保持土壤淹水（2～3 cm）至水稻收獲。試驗以不施硒肥為對照，設土壤施硒和葉面噴硒兩種施硒方式，兩種方式的施硒總量是相同的：通過人工加入硒酸鈉（Na2SeO4）的方法，于水稻幼苗移栽前每千克供試土壤添加0.75 mg硒與基肥充分混合施入，該硒濃度不會對水稻生長產生毒害作用［4］。葉面噴硒方法于水稻揚花期（此時葉片發育成熟）使用聚乙烯塑料布包裹水稻的辦法來噴硒，分三次噴施含硒濃度為50 μmol·L-1的溶液共1 L，每三天均勻噴施一次，噴施時間為早上八點至九點；噴施時添加表面活性劑有利于增加硒在水稻葉面上的潤濕、黏附與滲透，表面活性劑選擇脂肪醇聚氧乙烯醚，濃度為0.3 mmol·L-1；葉面噴施所用硒肥同為硒酸鈉（Na2SeO4），葉面噴施的硒濃度對水稻生長也無不利影響［5］，同時用1 L去離子水按相同方法葉面涂抹土壤施硒處理和對照處理的水稻，每個處理重復5次。水稻種子經10% H2O2（v/v）表面消毒15 min后用去離子水徹底洗凈，于不透光培養盆中催芽24 h，種子露白后移至酸洗后的石英砂（保持濕潤）中育苗，7 d后移栽。每桶移栽2～4株生長情況一致的幼苗（最終保留2株）。

1.3 試驗測定與質量控制

水稻成熟期收獲水稻植株，將其按不同的器官（根、莖和籽粒）進行分離，并用去離子水沖洗干凈后烘干、磨碎，保存于密封塑料袋用于生物量及化學測定。所有玻璃器皿均于10%稀鹽酸溶液中浸泡過夜，用去離子水洗凈后烘干使用。

植株總硒的測定：植株樣品經電熱爐加混合酸（HNO3∶HClO4= 4∶1）消化后，用原子熒光光譜法（AFS， AFS-920，北京吉天儀器有限公司）測定溶液中的Se含量［10］。

植株總氮和總磷的測定：植株樣品經混合酸（H2SO4-HClO4）消化后，總氮采用半微量凱氏定氮法測定，總磷采用釩鉬黃比色法測定［11］。

植株鎂（Mg）、鐵（Fe）、錳（Mn）、鋅（Zn）和硫（S）的測定：植株樣品消化處理同總硒的測定。四種金屬元素（Mg、Fe、Mn、Zn）采用原子吸收分光光度法測定；S的測定取濾液20 mL加入1粒攪拌籽后置于電磁攪拌器上依次加入1∶1 HCl 1 mL、無水乙醇5 mL，0.5%阿拉伯膠100℃水溶液后攪勻，加入1 mol·L-1BaCl2溶液5 mL后準確攪拌1 min后取下，于分光光度計波長420 nm下測定［11］。

植株硼（B）的測定：植株樣品于瓷坩堝經馬福爐灰化后，冷卻后準確加入1 mol·L-1HCl 10 mL，水浴加熱10 min后用熱純水轉移定容100 mL，用電感耦合等離子體原子發射光譜法（ICP-AES， Optima 2000，Perkin Elmer Co，Waltham，MA，美國）測定［11］。

為驗證消化過程和隨后分析的準確性和精度，標樣（GBW07605，中國標準物質研究中心）和空白與樣品同時消化，以確保消煮后計算回收率［12］。

水稻籽粒硒形態的測定：準確稱取磨碎水稻籽粒0.200 0 g于離心管中，加入蛋白酶K 20 mg，脂肪酶Ⅶ 10 mg，30 mmol·L-1Tris-HCl（三羥甲基氨基甲烷鹽酸）緩沖液（pH 7.5）5 mL，置于37℃恒溫搖床中24 h，遮光，搖床設置60 r·min-1。后移至離心機中離心30 min，離心機設置3 000 r·min-1，上清液過0.22 μm濾膜，濾液采用高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜儀（HPLC-ICPMS，NexION300X，美國）聯合測定法測定硒的五種形態：硒代蛋氨酸（SeMet）、甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys）、硒代半胱氨酸（SeCys）、硒酸鈉（SeⅥ）和亞硒酸鈉（SeⅣ）［6］。

水稻籽粒營養品質的測定：水稻籽粒于500～550℃馬福爐中焚燒至質量恒定，得到總灰分含量，準確灰分含量為± 0.01%～0.03%?？偟艘?.95得到粗蛋白含量［13］。采用中國農業部測定方法［14］測定直鏈淀粉含量。采用索氏提取法（SEM, BSXT-06, 上海比朗儀器制造有限公司）測定脂質。氨基酸采用鹽酸水解法測定［15］。

1.4 試驗數據處理

使用Excel 2010和SPSS 18.0軟件進行繪圖及單因素方差分析處理，采用最小顯著差異法（LSD）統計方法進行顯著性檢驗。

2 結 果

2.1 不同施硒方式對水稻生物量的影響

與對照組相比，葉面噴硒和土壤施硒兩種處理方式對于水稻根部、地上部和籽粒各器官的生物量無顯著影響（圖1），說明該試驗的土壤施硒和葉面施硒用量對水稻生長未產生不利影響。

圖1 不同施硒方式下水稻根部、地上部和籽粒的生物量Fig. 1 Biomass of root, shoot and grain of rice relative to Se application method

2.2 不同施硒方式對水稻體內各部位硒含量的影響

土壤施硒處理對于提高水稻各部位硒含量的效果最為顯著，根部、地上部和籽粒硒含量均顯著高于葉面噴硒處理（圖2）。葉面噴硒和對照組水稻根部硒含量極少，分別為0.09和0.01 mg·kg-1，而土壤施硒水稻根部硒含量則高達8.81 mg·kg-1。對于地上部和籽粒而言，土壤施硒處理硒含量分別為葉面噴硒的8.9倍和5.3倍，說明土壤中的硒能夠更好地被水稻各個器官吸收利用。

圖2 不同施硒方式下水稻根部、地上部和籽粒的硒含量Fig. 2 Se content in root, shoot and grain of rice relative to Se application method

圖3 不同施硒方式下水稻根部、地上部和籽粒硒所占比例Fig. 3 Se distribution in root, shoot and grain of rice relative to Se application method

由圖3可以看出，施硒方式的不同，硒在水稻體內各部位所占的比例不同。土壤施硒和葉面噴硒兩種不同施硒方式下水稻地上部中的硒分配系數仍然是最大的，分別為65%和72%，說明水稻體內的硒主要積累在地上部。土壤施硒處理根部硒分配系數為21%，相比之下，葉面噴硒處理根部硒含量所占比例極少，約為2%；同時，葉面噴硒處理水稻籽粒中的硒分配系數為26%，約為土壤施硒處理的2倍，這說明葉面噴硒能夠更好地將硒轉運至籽粒中，而不需要被根部積累，阻止硒的轉運。綜上所述，兩種施硒方式下水稻硒含量差異的關鍵在于根部吸收土壤中的硒較葉面吸收機制更加高效。

2.3 不同施硒方式對水稻籽粒硒形態的影響

兩種施硒方式下水稻籽粒各形態的硒含量差異較大，土壤施硒處理各形態硒含量均遠高于葉面噴硒處理（表1），這可能與水稻籽粒硒含量高低有關。但兩種不同施硒方式水稻籽粒中各形態硒在所有形態硒中所占比例幾乎無差異，說明不同施硒方式對水稻籽粒中硒形態分布無顯著影響。兩種施硒方式下水稻籽粒中有機硒（SeMet、MeSeCys和SeCys）占所有形態硒的92.7%，無機硒（Se(Ⅵ)和Se(Ⅳ)）在所有形態硒中僅占7.3%（表1），說明水稻籽粒中的硒主要以有機態的形式存在。其中，SeMet是最主要的存在形式，約占所有形態硒的82%；其次是MeSeCys和SeCys，分別占6.5%和4.2%，Se(Ⅵ)和Se(Ⅳ)含量基本一致。說明施入的無機硒在水稻體內不僅會向有機態轉化，也會向不同形態的無機態轉化。

表1 不同施硒方式下水稻籽粒硒形態Table 1 Forms of Se in grain of rice relative to Se application method

2.4 不同施硒方式對水稻籽粒必需礦質元素含量的影響

不同施硒方式對水稻籽粒必需礦質元素的含量均有不同程度的影響（表2）。施硒方式對籽粒氮含量無顯著影響，但相比對照組，籽粒氮含量在葉面噴硒處理和土壤施硒處理下仍然分別減少了2.8%和8.8%；籽粒磷含量和硼含量也符合這一規律：施硒處理相比對照組均有所減少，但土壤施硒處理籽粒磷含量顯著低于葉面噴硒和對照組，后兩者之間無顯著差異；土壤施硒處理籽粒硼含量和葉面噴硒之間無顯著差異，且均顯著低于對照組。對于所有金屬元素（鎂、鐵、錳和鋅）而言，土壤施硒處理下籽粒含量均顯著高于葉面噴硒和對照組；葉面噴硒處理籽粒除了錳含量顯著高于對照組以外，其他金屬元素含量均與對照組無顯著差異。籽粒硫含量和錳含量規律相似，土壤施硒處理籽粒硫含量顯著高于葉面噴硒，葉面噴硒處理硫含量顯著高于對照組。

表2 不同施硒方式下水稻籽粒礦質元素含量Table 2 Contents of mineral elements in grain of rice relative to Se application method/(g·kg-1)

2.5 不同施硒方式對水稻籽粒粗蛋白、淀粉、脂

質和灰分的影響

除粗蛋白以外，不同施硒方式對水稻籽粒其他指標（淀粉、脂質和灰分）含量無顯著影響（表3）。水稻施硒能夠顯著提高籽粒粗蛋白含量，相比對照組，土壤施硒處理和葉面噴硒處理分別提高了8.1%和4.5%，這可能是由于硒能夠促進水稻籽粒合成更多的蛋白質。

表3 不同施硒方式下水稻籽粒粗蛋白、淀粉、脂質和灰分情況Table 3 Nutritional status of grain of rice relative to Se application method/(g·kg-1)

2.6 不同施硒方式對水稻籽粒氨基酸含量的影響

在測得的16種氨基酸中，不同施硒處理對其中11種氨基酸（天冬氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、丙氨酸、脯氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸和組氨酸）在水稻籽粒中的含量基本無顯著影響（表4）。與對照相比，兩種施硒處理下籽粒中絲氨酸和酪氨酸含量均高于對照組，其中酪氨酸含量在土壤施硒處理下顯著高于葉面噴硒處理，前者是后者的1.15倍；絲氨酸含量在兩種不同施硒方式之間差異不顯著，但葉面噴硒處理下含量略高于土壤施硒處理。籽粒中的半胱氨酸含量在施硒處理下顯著降低，其中葉面噴硒處理降低程度更顯著。籽粒中甲硫氨酸含量在土壤施硒處理和葉面施硒處理之間無顯著差異，相比對照組均顯著降低。籽粒中精氨酸含量在土壤施硒處理下顯著降低，在葉面施硒處理下顯著升高。綜上所述，施硒方式的不同對水稻籽粒氨基酸的影響是不同的。

表4 不同施硒方式下水稻籽粒氨基酸含量Table 4 Contents of amino acids in grain of rice relative to Se application method/(g·100g-1)

3 討 論

3.1 不同施硒方式對水稻籽粒硒生物強化效應的影響

本研究的噴硒劑量對水稻的生長不會產生毒害作用（圖1）。兩種施硒方式對水稻籽粒生物量均無顯著影響，與陳雪等［16］的研究結果一致，而Boldrin等［17］卻認為葉面噴硒能夠顯著提高水稻產量。可見，施硒對水稻產量提高的效果很大程度上受到實驗條件和管理方法的影響。兩種施硒方式均能顯著提高水稻地上部及籽粒硒含量（圖2），其中，土壤施硒處理下水稻體內總硒及各部位的硒含量均顯著高于葉面噴硒，說明土壤中施入的硒能夠更好地被水稻吸收利用，而水稻葉片吸收硒的能力較弱。其原因可能有以下兩點：一方面，相比前人的葉面噴施亞硒酸鹽相關研究［5］，本實驗中葉面噴施硒酸鹽所表現的富硒效應較差，可能和硒源形態差異有關。葉面噴施的亞硒酸鹽能夠較快的被葉片吸收轉運，而土壤施加的亞硒酸鹽容易被土壤固定，從而降低其生物有效性［18-19］；相反，本研究所施用的硒酸鹽不容易被土壤表面鐵鋁氧化物固定，具有更強的生物有效性［20］。另一方面，葉面噴硒僅在揚花期進行，硒在葉面接觸的時間較短，并且葉面部分硒溶液會發生蒸騰損失，也可能部分硒在葉面中同化為有機硒揮發，進而導致葉面硒的籽粒利用率不高；而土壤中的硒與水稻根系接觸時間長，吸收更加充分。

從圖3可以看出，兩種不同施硒方式下，硒在水稻體內各部位的分配系數差異顯著。本試驗中，葉面噴硒處理水稻籽粒硒的分配系數為土壤施硒處理的2倍，反之，土壤施硒處理水稻根部硒的分配系數較葉面噴硒處理高約12倍?？赡苁怯捎谕寥乐形盏奈猁}70%以上均積累在地上部（特別是莖葉）［16］，從而降低硒的轉運效率。因此，相比通過根系吸收轉運至籽粒中的過程，水稻硒從葉面直接通過韌皮部轉運至水稻籽粒中的過程可能更加高效，能夠將進入植物體內的硒更多地分配至籽粒中，避免了在長距離運輸過程中的損失。因此，提高葉片吸收硒的效率是水稻硒生物強化的關鍵，尚需要進一步研究。

土壤施硒和葉面噴硒處理之間籽粒硒含量差異巨大（圖2），導致土壤施硒處理籽粒有機硒含量顯著高于葉面噴硒（表1），但兩種不同施硒方式下水稻籽粒中有機硒含量占總硒比例基本相等且均大于80%（表1），結果與之前的研究［21-22］相似，說明葉面噴硒可能會降低水稻籽粒有機硒含量，但不會降低其轉化率，有機硒（硒蛋白和含硒多糖）依然是植株體內硒的主要形式［23］。一般認為，硒酸鹽進入植物體之后，首先通過硫酸化酶和還原酶作用轉化為亞硒酸鹽，此反應主要發生在葉綠體中［24］，這也是水稻籽粒中最終檢測出少量亞硒酸鹽的重要原因之一（表1）。亞硒酸鹽還原至硒化物的過程由亞硫酸鹽還原酶介導，僅發生在葉綠體中［24-25］；還原型谷胱甘肽（GSH）也能將亞硒酸鹽還原，其過程也多發生在葉綠體中［25-26］。硒代蛋氨酸（SeCys）向其他硒代氨基酸轉化的過程也受到兩種葉綠體酶（胱硫醚-γ-合成酶CγS和胱硫醚-β-裂解酶CbL）的調控［27］。綜上所述，水稻體內硒酸鹽轉化為有機硒的過程發生在葉片中，證明了施硒方式并不會影響硒在水稻體內的同化代謝過程。

3.2 不同施硒方式對水稻營養品質的影響

如表2所示，兩種不同施硒方式下水稻籽粒其他礦質元素含量的變化表明了硒和其他元素可能存在某些相互關系。土壤施硒籽粒中的磷（P）含量顯著降低，可能是由于亞硒酸鹽和磷可能共用磷轉運子，兩者之間是競爭抑制的關系［28］。本試驗的硒源為硒酸鈉，同時，葉面噴硒處理籽粒硒轉化量也極少，因此，葉面噴硒對磷的吸收轉運無影響；而土壤施硒籽粒中亞硒酸鹽轉化得多。此外，土壤施入的硒酸鈉會被部分轉化為亞硒酸鈉［29］，進而降低水稻籽粒磷含量。Feng等［30］認為，中國蕨體內鎂含量升高是一種應對硒毒害的調節機制，可能與之類似，土壤施硒顯著增加了水稻籽粒Mg含量（表2）。施硒均顯著提高水稻籽粒S含量（表2），說明硒硫存在協同關系，與前人結果一致［31］。水稻籽粒Fe、Mn和Zn含量在土壤施硒處理下均顯著提高，與Boldrin等［17］的結果一致，說明硒酸鹽和這些金屬元素可能存在協同作用，增強了這些元素的吸收。水稻籽粒B含量在外源硒的加入下顯著降低，兩者之間可能存在拮抗抑制作用，其中的機制尚有待進一步研究。

粗蛋白、淀粉、脂質和灰分含量是水稻籽粒營養品質的重要指標，對稻米的食用品質具有重要影響。從表3可以看出，除粗蛋白含量顯著提高，兩種施硒方式對水稻籽粒其他營養指標均無顯著影響。周遺品［32］研究表明，通過施用適量硒肥可提高稻米中蛋白質和氨基酸含量，可能與硒進入水稻體內形成硒蛋白有關。對16種測得的氨基酸進行比較后發現，兩種施硒處理下水稻籽粒中半胱氨酸（Cys）和甲硫氨酸（Met）含量相比對照組均顯著降低（表4）。半胱氨酸和甲硫氨酸均是含硫氨基酸，硒進入植物體內沿著硫代謝途徑取代了含硫氨基酸中的硫，形成了硒代硫氨基酸（硒代半胱氨酸、硒甲基硒代半胱氨酸、硒代甲硫氨酸、硒甲基硒代甲硫氨酸等）［33］，從而導致含硫氨基酸含量減少，其中，葉面噴硒處理含硫氨基酸較土壤施硒減少得更多，也從側面證明了土壤中施入的硒酸鹽部分被轉化為亞硒酸鹽，但其機理還有待于進一步研究。施硒顯著提高了絲氨酸（Ser）和酪氨酸（Tyr）含量（表4）。研究表明，酪氨酸這類支鏈氨基酸對植物細胞骨架的結構有重要影響，維護植物細胞結構形態［34］，說明施硒可能增強水稻抗性。朱曄榮等［35］在報告中指出，內源絲氨酸可能與植物衰老有關。施硒提高了水稻籽粒絲氨酸含量，是否進一步促進籽粒成熟，還需要從分子水平進一步探究。土壤施硒下水稻籽粒精氨酸含量顯著降低，而葉面噴硒下精氨酸含量反而顯著升高（表4）。由于精氨酸具有貯藏氮元素營養的功能，其含量變化可能與氮元素的增減有關。

綜上所述，兩種不同施硒方式影響水稻營養品質差異是由水稻籽粒富集的硒含量多少決定的。土壤施硒水稻籽粒中的硒含量顯著高于葉面施硒，其有機硒含量、亞硒酸鹽含量也因此顯著高于葉面施硒。其結果導致了土壤施硒水稻籽粒中有更多的硒和其他元素產生相互（拮抗、協同）作用，并且進入水稻體內的代謝過程，進一步影響水稻籽粒的蛋白質和氨基酸水平，影響其營養品質。

4 結 論

在等量施硒條件下，土壤施硒和葉面噴硒兩種方式均能顯著提高水稻地上部和籽粒硒含量，土壤施硒較葉面噴硒更能有效提高籽粒硒含量，但是硒通過葉片向籽粒轉運能力較通過根系至籽粒的轉運能力更強。施硒方式的不同對水稻籽粒硒形態無顯著影響，說明施硒方式僅影響水稻體內硒的轉運而對其同化代謝無影響。施硒能夠顯著提高水稻籽粒中鎂、硫、鐵、錳和鋅等部分礦質營養元素含量，進而提高水稻營養品質，以土壤施硒效果更佳。兩種施硒處理下籽粒中絲氨酸和酪氨酸含量均顯著提高，其中，酪氨酸含量在土壤施硒處理下顯著高于葉面噴硒處理。綜上所述，土壤施硒酸鈉對于水稻籽粒硒生物強化以及營養品質提高效果均強于葉面噴硒。