電針對功能性消化不良大鼠胃竇AMPKα及mTOR的影響*

唐 雷 徐派的 張紅星 康朝霞

（湖北中醫藥大學，武漢 湖北 430065）

功能性消化不良（FD）是指起源于胃或十二指腸的消化不良癥狀，表現為早飽感、餐后飽脹不適、上腹灼熱感或上腹疼痛，且器質性和代謝性疾病無法解釋這些癥狀［1］。FD患病率為11.5%～29.2%，且在不斷上升，嚴重影響患者的生活及工作［2］。由于FD發病機制復雜，藥物治療存在副作用，且個體差異性明顯，近年來應用電針治療FD的療效得到大量實驗及臨床研究支持［3-5］。在以往研究中我們也發現，電針足三里穴可有效地促進消化功能的恢復，并可恢復FD大鼠的血漿胃促生長素（Ghrelin）水平［6］，但 Ghrelin 的調節機制還不清楚。有研究發現大鼠胃黏膜中雷帕霉素靶蛋白（mTOR）與Ghrelin有共定位現象，可以調節食物攝取［7］。還有研究表明大鼠神經、胃腸等組織中的腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）的表達與電針干預作用有關［8］。本研究旨在觀察電針足三里對FD大鼠AMPKα及mTOR的影響，初步探討電針治療FD的相關機制?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選用8～12周齡無特定病原體（SPF）級 SD 大鼠 50 只，體質量（200±20） g，雌雄各 25 只，8～12周齡，購買于湖北實驗動物研究中心，動物許可證號：SCXK（鄂）2011-0012。將上述大鼠飼養于湖北中醫藥大學SPF動物房內，相對濕度50%～70%，室溫22℃。適應性喂養1周后開始實驗。

1.2 試劑與儀器 主要試劑包括RIPA蛋白裂解緩沖液、BCA蛋白濃度檢測試劑盒、Western一抗、二抗稀釋液（均購于上海碧云天生物技術有限公司）、AMPKα抗體（sc33524，SANTA 公司）、mTOR 抗體（Ab109268，Abcam 公司）、actin 內參抗體（A20120A0702，BioTNT公司）、 羊抗兔 IgG （PAB150011，Bio-swamp公司）、RNA逆轉錄試劑盒（639505，TAKAPA公司）等；主要實驗儀器包括高速低溫離心機（X-22，美國Beckman公司）、全自動檢測酶標儀（168-1002XC，美國BIORAD 公司）、Western電泳儀 （Mini-Trans Blot， 美國BIO-RAD公司）、實時熒光定量PCR儀（CFX-96，美國BIO-RAD公司）、無菌針灸針（0.25 mm×10.0 mm，蘇州醫療用品有限公司）、韓氏電針儀（HANS-200A，南京濟生醫療科技有限公司）等。

1.3 分組與造模 按隨機數字表法挑選10只大鼠納入正常組，余40只大鼠進行造模，14 d后剔除造模未成功大鼠。采用隨機數字表法將造模成功大鼠分為模型組及電針組，每組10只。本實驗經湖北中醫藥大學實驗動物倫理委員會審核、許可。造模方法參考王煜姣等［9］的方法，采用不規則飲食配合夾尾刺激法，制模大鼠每逢周一、周三、周五禁止攝食、飲水，同時用長海綿鉗夾大鼠尾巴末端1/3處，以不破皮但使其尖叫掙扎為度，讓大鼠之間相互廝打，每日 2 次（9∶00，16∶00），每次持續30 min，連續刺激14 d。大鼠出現飲水及飲食明顯減少，毛發變黃，枯燥無光澤，倦臥活動減少，情緒低落抑郁，容易激惹，提示造模成功。

1.4 干預方法 采用自制鼠衣束縛電針組FD大鼠，并將其懸掛于自制裝置上，參照 《大鼠穴位圖譜的研制》［10］選取“足三里”穴，用 1寸針灸針針刺 FD 大鼠雙側“足三里”穴，針刺深度為0.3～0.5寸，進針后接通HANS-200A電針儀；設置電針刺激參數如下：疏密波，頻率2 Hz/100 Hz，電刺激強度2 mA，每次 30 min，每日1次，共治療10 d。在電針組進行電針刺激同時，正常組及模型組大鼠也進行束縛固定（同電針組），但不給予針刺及電針干預。

1.5 標本采集與檢測 最后一次治療結束后大鼠禁食24 h，給予腹腔麻醉 （將7%水合氯醛配成0.5 mL/100 g劑量），然后將大鼠固定，剖開腹腔后結扎胃賁門和胃幽門，剪開胃體，清洗胃內容物后拭干，剪取胃竇組織裝于EP管中，立即用液氮凍存，最后置于-80℃冰箱中保存待測。1）采用Western blotting法檢測大鼠胃竇AMPKα、mTOR蛋白表達。取100 mg胃竇加入1 mL裂解液勻漿，將裂解后的樣品在4℃、12 000 g條件下離心15 min，取上清進行蛋白質定量后貯存于-80℃冰箱中。根據待測蛋白的分子量配置SDSPAGE凝膠，然后電泳轉膜，封閉1 h孵育一抗4℃過夜，第2天孵育二抗后顯影。2）采用qRT-PCR技術檢測大鼠胃竇AMPKα、mTOR mRNA表達。從-80℃冰箱中取100 mg胃竇，加入Trizol后研磨，多次離心后提取RNA，然后將RNA逆轉錄為cDNA，最后進行qRT-PCR擴增。其擴增方法如下：95℃預變性3 min，95℃變性5 s，56℃退火10 s，72℃延伸25 s，共進行40個循環；采用2-△△ct法進行數據分析。

1.6 統計學處理 應用SPSS19.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，符合正態分布的計量資料組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊時采用最小顯著差異法（LSD），方差不齊時采用 Dunntt′s T3法，不符合正態分布數據比較采用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠一般情況 造模過程中正常組大鼠各項活動均正常，模型組大鼠從第7日開始發現籠內糞便稀拉，可聞到鼠籠內有明顯穢臭，第10～14日發現部分大鼠進食、打斗明顯減少，毛發暗黃、不柔順、無光澤，情緒低落萎靡，提示FD大鼠造模成功。與模型組比較，電針組大鼠經電針刺激后，發現大鼠活動增多，進食增加，毛發逐漸恢復光澤、柔順。

2.2 各組大鼠胃竇組織中AMPKα和mTOR mRNA的表達比較 見表1，圖1。與正常組大鼠比較，模型組FD大鼠胃竇中AMPKα mRNA的表達水平明顯降低（P＜0.05），mTOR mRNA 的表達水平顯著升高（P＜0.05）。與模型組FD大鼠比較，電針組FD大鼠胃竇中AMPKα mRNA的表達水平明顯升高 （P＜0.05），mTOR mRNA的表達水平顯著降低（P＜0.05）。

表1 各組大鼠胃竇中AMPKα和mTOR mRNA的表達量比較（x±s）

圖1 各組大鼠胃竇中AMPKα和mTOR mRNA的表達量

2.3 各組大鼠胃竇中AMPKα和mTOR蛋白的表達比較 見表2，圖2。與正常組大鼠比較，模型組FD大鼠胃竇中AMPKα蛋白的表達量顯著降低 （P＜0.05），mTOR蛋白的表達量顯著升高（P＜0.05）；與模型組FD大鼠比較，電針組FD大鼠胃竇中AMPKα蛋白的表達量明顯升高 （P＜0.05），mTOR蛋白的表達顯著降低（P＜0.05）。

表2 各組大鼠AMPKα和mTOR蛋白的表達量比較（x±s）

圖2 各組大鼠胃竇中AMPKα和mTOR蛋白的表達量

3 討 論

本研究結果提示，與正常組大鼠比較，模型組FD大鼠毛發暗黃、不柔順、無光澤，進食、打斗均減少，狀態低落萎靡；胃竇組織中AMPKα mRNA以及蛋白表達水平顯著降低，mTOR mRNA以及蛋白表達水平顯著升高。與模型組比較，電針組FD大鼠毛發逐漸恢復光澤、柔順，活動及進食量均增加，胃竇組織中AMPKα mRNA以及蛋白水平明顯升高，mTOR mRNA以及蛋白表達水平明顯降低。

與同類研究比較［11-12］，雖然最終結果均提示電針能調節FD大鼠胃運動功能，但作用機制還是有所區別。王柳等認為電針可能是通過改變大鼠迷走神經背核（DMV）區 N-甲基-D-天冬氨酸受體（NMDAR）活性從而調節血清NO含量并發揮治療作用［11］。楊云等認為電針足三里改善胃腸功能的作用機制可能為降低FD 大鼠胃竇及血漿中神經降壓素（NT）的表達［12］。

Ghrelin是一種重要的胃腸激素，具有控制食欲、增強胃動力等作用，與機體胃腸功能具有高度相關性，在胃腸動力學中的調節機制一直是研究熱點。mTOR作為一種高度保守的蘇氨酸/絲氨酸蛋白激酶，是Ghrelin的調節因子之一，分子大小為259 kDa，可以感知能量穩態的變化，研究發現多種蛋白的合成、增殖、自噬等過程與它有關，多種細胞的生長及細胞周期進程也與它密不可分［13］。研究還表明胃竇組織中mTOR的變化也會導致Ghrelin表達量的改變，從而影響食物攝?。?4］。

AMPK蛋白以異源三聚體復合物的形式存在，分別由不同的基因表達兩種亞型：α-亞基和β-亞基。AMPKα作為mTOR的上游調節分子之一，是調節細胞內能量代謝的重要調節因子，廣泛存在于骨骼肌、胃腸、胰腺等組織系統中，能夠精確地反映細胞能量狀態的變化［15-16］。研究發現，電針作為治療手段，能有效地增加相關疾病模型大鼠的骨骼肌、胃腸、神經等組織中AMPKα的表達［17-18］。還有研究表明活化的AMPKα可以直接磷酸化結節性硬化癥復合物（TSC），促進TSC1/2復合物形成，競爭性地抑制mTOR的活性［19］。結合上述分析及本課題研究結果，在電針足三里治療功能性消化不良的過程中，可能存在基于AMPKα變化而調節mTOR的機制。

FD屬于中醫學的“胃脘痛”范疇，病機為本虛標實，脾虛為本，氣滯、食積、痰濕、血瘀為標。脾為氣機之樞，主運化，主升，胃主受納，主降，脾升胃降才能維持消化道正常運化、受納、腐熟的功能。足三里穴是足陽明胃經合穴，又為胃的下合穴，能補脾胃，調腸腑，為后天生化之源?！端目傃ǜ琛吩啤岸歉谷锪簟?。《靈樞·邪氣臟腑病形》曰“合治內腑”。《素問·水熱穴論》云“氣街、三里、巨虛上下廉，此八者以瀉胃中之熱也”。這些都充分說明了足三里穴善治脾胃病的特點，是胃腸疾病中最常見的取穴。電針是通過各種物理化學方式刺激相關腧穴，從而激發經絡之氣，促進陰陽協調，達到防治疾病的目的［20］。這也是采用電針足三里穴治療功能性消化不良的原因。

綜合本研究結果來看，電針足三里穴可改善FD大鼠的胃腸消化，增加FD大鼠胃竇AMPKαmRNA以及蛋白的表達水平、降低FD大鼠胃竇mTOR mRNA以及蛋白的表達水平可能是其作用機制之一，但電針是如何影響mTOR和AMPKα、mTOR與AMPKα的相互作用機制等還需進一步行嚴謹的實驗來深入研究。