丹參酮ⅡA注射液對缺血缺氧性腦損傷新生大鼠皮質神經元自噬及Akt-mTOR通路的影響*

朱 波 楊 艷 蘇仁意 許細平 孫乾朕

（湖北醫藥學院附屬襄陽市第一人民醫院，湖北 襄陽 441000）

缺氧缺血性腦損傷（HIBD）是造成新生兒多種神經功能障礙的疾病之一，嚴重威脅新生兒生命健康［1］。據調查，圍生期HIBD新生兒死亡率高達20%，經治療幸存患兒中約40%存在腦神經損害等后遺癥［2］。目前，HIBD主要依靠亞低溫療法進行治療，但其預后效果并不理想。相關研究指出，病理性神經元自噬是造成多種神經元損傷凋亡的重要原因之一［3］。因此，尋找調節神經元自噬藥物的研究是目前治療HIBD的新思路。丹參酮ⅡA是丹參主要有效成分之一，難溶于水，易溶于有機溶劑。丹參酮ⅡA因含有醌型結構，具有多種藥理藥效，例如改善冠狀動脈循環、修復心肌損傷、抗細胞凋亡、神經保護等［4］。相關研究顯示，丹參酮ⅡA對多種臟器的缺氧缺血性損傷具有保護作用［5-6］。任陳等研究發現丹參酮ⅡA能明顯減輕放射線在體外對海馬神經元細胞的放射損傷作用，并推測其保護機制可能與調節放療過程中神經元自噬相關［7］。因此，本研究擬通過建造新生大鼠缺血缺氧性腦損傷模型，觀察丹參酮ⅡA對HIBD新生大鼠皮質神經元自噬及Akt-mTOR通路影響并探討其機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級7日齡SD（Sprague-Dawley）大鼠80，雌雄不計，體質量11.6～12.17 g，平均體質量（11.98±0.32）g，由河南省實驗動物中心提供，許可證號：SYXK（豫）2015-0003。

1.2 試劑與儀器 丹參酮ⅡA磺酸鈉購自上海上藥第一生化藥業有限公司，國藥準字H31022558，批號160916。蛋白酶抑制劑購自上海子起生物科技有限公司，貨號E429-10MG。RIPA裂解液購自北京君諾德生物技術有限公司，貨號7011A。BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自上海經科化學科技有限公司，貨號JK-201。LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p-Akt、p-mTOR、p-S6、GADPH蛋白抗體及HRP綴合的二抗均購自藥明康德。透射電子顯微鏡購自尼康儀器（上海）有限公司。酶標儀購自美國伯騰儀器。

1.3 分組與造模 將SD幼鼠隨機分為5組，每組16只，分別為假手術組、模型組、高劑量組（0.1 mg/g）、中劑量組（0.05 mg/g）、低劑量組（0.02 mg/g）。假手術組僅左頸部切口處理，其余各組進行造模。3%乙醚麻醉幼鼠，手術暴露左側頸主動脈，分離神經，結扎血管，縫合傷口。放回原飼養環境，恢復3 h后，將幼鼠置于常壓缺氧艙內，溫度37℃，濕度45%～55%，持續通入8%O2和92%N2缺氧處理2.5 h，幼鼠出現左旋即為造模成功。

1.4 給藥方法 高劑量組、中劑量組、低劑量組幼鼠分別給予不同劑量的丹參酮ⅡA注射液，于出現左旋現象時腹腔注射1次，24 h后重復注射1次。假手術組與模型組分別按照上述給藥方式給予等體積0.9%氯化鈉注射液。

1.5 標本采集與檢測 1）大腦皮質超微結構觀察。缺氧缺血處理32 h后，取幼鼠斷頭取左腦，利用解剖鏡迅速剝離大腦皮質，置于冰上盛有2.5%戊二醛容器中進行處理，用1%鋨酸對腦組織進行固定，乙醇和丙酮不同濃度由低至高進行脫水，環氧樹脂包埋，切片，利用乙酸雙氧鈾和硝酸鉛染色，置于透射電子顯微鏡下觀察拍片。2）TTC染色觀察腦梗死面積。缺氧缺血處理36 h，取幼鼠斷頭，取左腦置于冰上。Rat Brain Matrix由前之后切片，厚度5 μm。室溫條件下，將切片置于2%TTC中，孵育35 min，PBS緩沖液洗滌，10%中性甲醛固定。數碼相機采集圖片，正常腦組織為紅色，梗死組織為白色。利用Image J對采集圖片急性分析，統計梗死面積百分比。3）蛋白免疫印跡法檢測腦組織自噬蛋白表達。缺氧缺血處理48 h，取幼鼠進行斷頭取腦，取左側腦組織，例用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取腦組織蛋白。4℃下10 000×g離心8 min后取上清，BCA蛋白濃度檢測試劑盒檢測總蛋白，10%SDS-PAGE分離膠分離蛋白，半干法轉移蛋白至PVDF膜上。PBS配制的5%脫脂乳對膜進行封閉，4℃過夜。棄封閉液，PBS緩沖液清洗膜5次，每次4 min。LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p-Akt、p-mTOR、p-S6 蛋白抗體及內參GADPH蛋白抗體作為一抗，室溫孵育3 h。棄溶液，PBS緩沖液洗滌5次，每次4 min。室溫條件下，HRP綴合的二抗孵育1.5 h。利用Image J軟件分析條帶灰度，評估蛋白相對表達量。

1.6 統計學處理 應用SPSS20.0統計軟件。計量資料以（x±s）表示，兩組間比較行t檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組新生大鼠大腦皮質超微結構 見圖1，表1。假手術組神經元結構正常，細胞核、線粒體、粗面內質網、高爾基體及溶酶體均正常存在。模型組中觀察到皮質神經元中存在大量的自噬體和自噬溶酶體，其泡狀自噬體中包裹有可見的細胞質結構。相較于模型組，高劑量組、中劑量組、低劑量組中自噬體數量明顯減少，且呈一定的劑量依賴性（P＜0.05）。

圖1 各組新生大鼠大腦皮質超微結構（乙酸雙氧鈾和硝酸鉛染色，5000倍）

表1 各組新生大鼠大腦皮質超微結構（x±s）

圖2 各組新生大鼠腦梗死組織切片

2.2 各組新生大鼠腦梗死比較 與假手術組比較，模型組中幼鼠大腦皮質、海馬等區域呈現明顯的大面積白色梗死。與模型組比較，高劑量組、中劑量組、低劑量組中幼鼠腦梗死程度均有所改善。見圖2。對各組中幼鼠腦梗死面積進行定量，發現與假手術組比較，模型組中幼鼠腦梗死面積顯著增加 （P＜0.05）。與模型組比較，高劑量組、中劑量組、低劑量組腦梗死面積顯著減小，且呈一定的劑量依賴性（P＜0.05）。見表2。

表2 各組新生大鼠腦梗死情況比較（%，x±s）

2.3 各組新生大鼠腦組織自噬蛋白表達情況比較

見圖3，表3。與假手術組比較，模型組新生大鼠腦組織中 LC3-Ⅰ/（LC3-Ⅰ＋LC3-Ⅱ）的比值顯著增高，差異具有統計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，高劑量組、中劑量組、低劑量組新生大鼠腦組織中LC3-Ⅰ/（LC3-Ⅰ＋LC3-Ⅱ）的比值顯著降低，呈劑量依賴性（P＜0.05）。模型組新生大鼠腦組織中Beclin-1蛋白表達水平與假手術組比較顯著上升（P＜0.05）。與模型組比較，高劑量組、中劑量組、低劑量組新生大鼠腦組織中Beclin-1蛋白表達水平顯著下降，且呈劑量依賴性（P＜0.05）。

圖3 各組新生大鼠腦組織自噬蛋白表達情況

表3 各組新生大鼠腦組織自噬蛋白表達情況比較（x±s）

2.4 各組新生大鼠腦組織中p-Akt表達情況比較

見圖4，表4。與假手術組比較，模型組新生大鼠腦組織中p-Akt蛋白的表達水平顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，高劑量組、中劑量組、低劑量組新生大鼠腦組織中p-Akt蛋白的表達水平顯著升高，呈劑量依賴性（P＜0.05）。

圖4 各組新生大鼠腦組織中p-Akt表達情況

表4 各組新生大鼠腦組織中p-Akt表達情況比較（x±s）

2.5 各組新生大鼠腦組織中p-mTOR表達情況比較見圖5，表5。與假手術組比較，模型組新生大鼠腦組織中p-mTOR蛋白的表達水平顯著降低（P＜0.05）。相較于模型組，高劑量組、中劑量組、低劑量組新生大鼠腦組織中p-mTOR蛋白的表達水平呈顯著升高，且呈劑量依賴性（P＜0.05）。

圖5 各組新生大鼠腦組織中p-mTOR表達情況

表5 各組新生大鼠腦組織中p-mTOR表達情況比較（x±s）

2.6 各組新生大鼠腦組織中p-S6表達情況比較 見圖6，表6。相較于假手術組，模型組新生大鼠腦組織中p-S6蛋白的表達水平顯著降低（P＜0.05）。相較于模型組，高劑量組、中劑量組、低劑量組新生大鼠腦組織中p-S6蛋白的表達水平呈顯著升高，且呈劑量依賴性（P＜0.05）。

圖6 各組新生大鼠腦組織中p-S6表達情況

表6 各組新生大鼠腦組織中p-S6表達情況比較（x±s）

3 討 論

HIBD的發生機制極其復雜，與氧自由基、神經元自噬、神經元凋亡等密切相關［9］。相關研究指出，大腦發生缺氧缺血早期便可引起細胞凋亡及神經元病理性自噬等［10］。本研究實驗顯示，與假手術組比較，模型組中幼鼠大腦皮層、海馬等區域呈現明顯的大面積白色梗死，表明造模成功；高劑量組、中劑量組、低劑量組中腦梗死面積較模型組顯著減小，且呈一定的劑量依賴性，表明丹參酮ⅡA能有效改善腦梗死情況。

自噬是降解細胞內蛋白和損傷細胞器，穩定細胞環境的主要方式［11］。相關研究指出，當自噬處于穩態平衡時對機體具有保護作用，但當自噬平衡狀態打破時，將導致機體出現損傷［12］。 Lu 等［13］研究中發現，新生大鼠缺血缺氧性腦損傷模型中自噬體數量明顯增加，自噬標志蛋白表達水平明顯上升，當自噬抑制劑作用于模型可顯著降低自噬體數量，抑制神經細胞凋亡，其認為自噬的激活對新生大鼠HIBD具有促進作用。相關研究發現，LC3（微管相關蛋白輕鏈3）可作為自噬形成標志物，當細胞受到某種刺激，位于細胞內的LC3-Ⅰ將脂質化為LC3-Ⅱ，參與形成自噬體，因此可根據分析LC3-Ⅱ/（LC3-Ⅰ+LC3-Ⅱ）的比值是否上調判斷自噬體的形成［14］。還有研究證實，Beclin-1為除 LC3外與自噬密切相關的蛋白，主要參與自噬過程啟動［15］。本研究結果發現，模型組中觀察到皮質神經元中存在大量的自噬體和自噬溶酶體，其中泡狀自噬體中包裹有可見的細胞質結構，同時與模型組比較，高劑量組、中劑量組、低劑量組中自噬體數量明顯減少，且呈一定的劑量依賴性。同時本研究結果還發現，模型組中LC3-Ⅱ/（LC3-Ⅰ+LC3-Ⅱ）的比值和Beclin-1蛋白表達水平較假手術組均顯著降低，表明缺氧缺血破壞神經元內穩定環境，造成蛋白錯誤修飾及細胞器損傷，從而通過上調Beclin-1蛋白表達水平啟動自噬，LC3-Ⅰ脂質化，形成自噬體。與模型組比較，高劑量組、中劑量組、低劑量組新生大鼠腦組織中LC3-Ⅱ/（LC3-Ⅰ+LC3-Ⅱ）的比值和Beclin-1蛋白表達水平顯著下降，且呈劑量依賴性，提示丹參酮ⅡA可通過抑制LC3-Ⅱ/（LC3-Ⅰ+LC3-Ⅱ）的比值和Beclin-1蛋白表達水平，抑制自噬過程。

Akt-mTOR信號轉導通路是哺乳動物腫瘤免疫中的重要信號通路，其對調節細胞的生長、增殖、自噬以及凋亡有重要的作用［16］。Akt被相關因子激活磷酸化，發生空間轉移，由胞漿轉移至細胞核，進而調控下游如mTOR、Caspase-9、cyclin-D1等相應的信號分子，其中mTOR發生磷酸化激活下游p70S6K，促進核糖體蛋白S6發生磷酸化，從而調控細胞自噬，此調節過程與自噬的形成具有負相關性［17］。Makhov等通過蓽茇明堿對mTOR信號影響的研究中發現，蓽茇明堿能有效抑制細胞中Akt靶蛋白的磷酸化，下調Akt可有效抑制下游mTORC1的活性與細胞自噬［18］。本研究實驗發現，與假手術組比較，模型組新生大鼠腦組織中p-Akt、p-mTOR、p-S6蛋白的表達水平均顯著降低，提示Akt-mTOR信號轉導通路參與調節神經元自噬，且呈負調節作用。與模型組比較，高劑量組、中劑量組、低劑量組新生大鼠腦組織中p-Akt、p-mTOR、p-S6蛋白表達水平均升高，并呈劑量依賴性，提示丹參酮ⅡA對Akt-mTOR信號轉導通路具有正調節作用。

綜上所述，丹參酮ⅡA對新生大鼠缺血缺氧性腦損傷具有顯著的改善作用，大腦皮質神經元自噬受到顯著的抑制，推測其機制可能為通過激活Akt-mTOR信號轉導通路，抑制神經元自噬，從而改善腦損傷情況。然而，缺血缺氧性腦損傷是一個極其復雜的過程，其具體調節機制還有待進一步研究。