淫羊藿苷對大鼠腦缺血-再灌注損傷的保護作用及機制研究*

閆 磊 梁 軍 董建將 孫曉冬 邵新然 蔡克瑞（牡丹江醫學院，黑龍江 牡丹江 157011）

缺血性腦血管病死亡率很高，腦缺血-再灌注是其主要的病理生理過程。淫羊藿是傳統中藥，淫羊藿苷（ICA）是淫羊藿中的主要活性成分。ICA具有調節免疫、抑制腫瘤、改善心腦血管功能、抗氧化損傷和抑制肝纖維化等功能［1-3］。本實驗通過建立大鼠腦缺血再灌注模型，探索ICA對大鼠腦缺血-再灌注損傷的保護作用及機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級大鼠40只，體質量300～400 g，雌雄不限（牡丹江醫學院實驗動物中心提供），動物許可證號：SYXK（黑）2015-007。所有大鼠飼養于標準條件下，12 h明暗交替，室溫控制在20～25℃，自由攝食飲水。

1.2 試藥與儀器 淫羊藿苷（陜西西安飛達生物技術有限公司，批號20120516；純度98.56%），谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）、髓過氧化物酶（MPO）、一氧化氮合酶（NOS）檢測試劑盒（南京建成生物工程有限公司），腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、血清白細胞介素-1β（IL-1β）酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.3 分組與造模 將大鼠隨機分成4組，即假手術組、模型組、ICA低劑量組（30 mg/kg）和ICA高劑量組（80 mg/kg），每組10只。術前給藥7 d，ICA低劑量組給予腹腔注射ICA（30 mg/kg）2 mL，ICA高劑量組給予腹腔注射ICA（80 mg/kg）2 mL，假手術組和模型組給予相同體積0.9%氯化鈉注射液，每日1次。制備腦缺血模型［4］：采用頸總動脈夾閉法。大鼠術前禁水4 h，禁食12 h，仰臥位固定后10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉，取頸部正中切口，鈍性分離頸總和頸內、外動脈，結扎頸外動脈。夾閉頸總動脈后撤掉動脈夾恢復血流后縫合。假手術組僅剝離但不夾閉頸總動脈。大鼠術后均同等條件下正常飼養，24 h后處死大鼠提取腦組織標本。

1.4 觀察指標 1） 測定腦組織 GSH-Px、SOD、MPO活性和MDA含量：將10%缺血側大鼠腦組織勻漿應用GSH-Px、SOD、MPO、MDA試劑盒操作，測定GSHPx、SOD、MPO活性和MDA含量。測定腦組織NO含量、NOS活性［2］將 10%組織腦勻漿 4℃下離心 10 min（3 000 r/min），取上清液。應用硝酸還原酶法測定NO含量，應用比色法NOS活性。2）測定腦組織TNF-α的含量：將缺血側大鼠腦組織勻漿后應用ELISA檢測試劑盒測定腦組織中TNF-α含量。3）測定血清IL-1β含量［5］：取頸靜脈血 2 mL，室溫靜置 1 h，離心 10 min（3 000 r/min），分離血清，-80 ℃保存，按 ELISA 檢測試劑盒說明書步驟操作測定血清IL-1β含量。

1.5 統計學處理 應用SPSS for windows 16.0統計軟件。計量資料以（x±s）表示，采用單因素方差分析統計學方法對所得數據進行分析，組間兩兩比較LDS檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠腦組織GSH-Px、SOD活性的比較 見表1。與假手術組比較，模型組GSH-Px、SOD活性差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，ICA低劑量組和ICA高劑量組大鼠腦組織GSH-Px、SOD活性明顯增高，差異有統計學意義（P＜0.01）。

表1 各組大鼠腦組織 GSH-Px、SOD、MDA、MPO水平比較（x±s）

2.2 各組大鼠腦組織MDA含量、MPO活性比較 見表1。腦缺血-再灌注24 h后，與假手術組比較，模型組MDA含量、MPO活性差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，ICA低劑量組和ICA高劑量組大鼠腦組織MDA含量、MPO活性明顯減低，差異有統計學意義（P＜0.01）。

2.3 各組大鼠腦組織NO、NOS、TNF-α含量比較 見表2。腦缺血-再灌注24 h后，與假手術組比較，模型組 NO、NOS、TNF-α 含量差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，ICA低劑量組和ICA高劑量組大鼠腦組織NO、NOS、TNF-α含量明顯減低，差異有統計學意義（P＜0.01）。

表2 各組大鼠腦組織NO、NOS、TNF-α和血清IL-1β含量比較（x±s）

2.4 各組大鼠血清IL-1β含量比較 見表2。腦缺血-再灌注24 h后，與假手術組比較，模型組差異有統計學意義 （P＜0.01）；與模型組比較，ICA低劑量組和ICA高劑量組大鼠血清IL-1β含量明顯減低，差異有統計學意義（P＜0.01）。

3 討 論

腦缺血-再灌注損傷是在腦缺血基礎上再灌注導致的腦組織進一步損傷，最終會導致神經細胞壞死或凋亡，其機制尚未完全明確。目前的研究表明，腦缺血-再灌注損傷主要與炎癥反應、興奮性氨基酸、細胞內鈣超載、氧自由基和細胞凋亡等幾方面有關［6］。缺血組織再灌注后，氧自由基可以引起微血管和實質器官的損傷；興奮性氨基酸、細胞內鈣超載和細胞凋亡可以對腦組織產生神經毒性作用；炎癥因子的釋放可以加重炎癥反應和細胞凋亡，并進一步增加腦水腫。因此，如何抑制腦缺血-再灌注氧自由基損傷、抑制神經毒性作用和抑制炎癥反應是已經成為目前腦缺血疾病方面研究的熱點。

淫羊藿屬于小檗科淫羊藿屬植物。《神農本草經》中首次記載了淫羊藿具有強筋骨、滋補腎陽、祛風濕等功效，以其干燥葉入藥，味辛、甘，性溫。ICA是傳統中藥淫羊藿的有效藥理成分。有研究發現ICA能夠上調神經生長因子的表達，營養神經細胞，改善記憶功能［7］，因此ICA在抗神經損傷領域有廣闊的研究前景［7-8］。但是其是否能在腦缺血-再灌注損傷中起到神經保護作用及機制尚未得到闡述。

GSH-Px和SOD是機體內清除自由基的重要抗氧化酶，其活性高低是反映機體清除氧自由基、抗氧化能力的重要指標。SOD在全身各組織廣泛分布，SOD可以與反應形成H2O2，H2O2經過過氧化物酶和GSHPx的催化生成水，從而清除自由基，保護細胞免受氧化性傷害。有研究顯示［9-11］，腦缺血-再灌注模型中，上調SOD活性可有效減輕腦缺血再灌注引起的組織損傷。MDA是不飽和脂肪酸過氧化作用的終產物，可嚴重破壞細胞膜結構，導致細胞腫脹、壞死、細胞膜通透性增加，造成細胞損傷。MDA含量可以間接反映出細胞受自由基損害和過氧化的程度。通常將GSH-Px活性、SOD活性和MDA含量聯系起來作為評估機體清除氧自由基、抗氧化能力指標。本實驗發現ICA可以增高腦缺血-再灌注損傷大鼠腦組織GSH-Px、SOD活性，減低MDA含量，增強機體清除氧自由基的能力，抑制氧自由基損傷，具有神經保護作用。

NO是廣泛分布于神經組織中的一種新型生物信息傳遞分子。在腦缺血再灌注損傷中，NO具有神經保護和神經毒性雙重作用。機體健康狀態時NO可以通過增強突觸傳遞，抑制受體以及舒張血管增加腦血流量等機制起到腦神經保護作用；但體內NO積聚時，NO可通過損傷線粒體、鈣超載、細胞凋亡、介導興奮性氨基酸的毒性及氧自由基損害等機制對腦組織產生神經毒性作用，加重腦缺血損傷。NO合成的限速酶是NOS，其活性是決定NO發揮保護或損傷雙重作用的關鍵因素［4，10］。本實驗發現ICA可以減少腦缺血-再灌注損傷大鼠腦組織NO含量、NOS活性，抑制NO增高導致的神經毒性損傷，具有神經保護作用。

炎癥反應是腦缺血再灌注損傷影響因素中的重要的環節［13-14］。MPO是中性粒細胞的特異性標志物，MPO的活性可以反映炎癥反應的程度［13］。 TNF-α、IL-1β 都是主要的促炎因子［14］：TNF-α的激活在腦缺血炎癥反應中起著核心作用。TNF-α可以介導炎癥級聯反應，誘導巨噬細胞、內皮細胞、膠質細胞及炎癥遞質等的表達，加重腦損傷［15］；IL-1β可以誘導中性粒細胞黏附于內皮細胞及其基質并通過內皮進入缺血區，通過釋放氧自由基、堵塞微血管等途徑加重腦損傷［5］。本實驗發現ICA可以減少腦缺血-再灌注損傷大鼠腦組織MPO活性、TNF-α含量和血清IL-1β含量，抑制炎癥反應，具有神經保護作用。

綜上所述，本實驗通過建立大鼠腦缺血-再灌注模型，發現ICA對大鼠腦缺血-再灌注損傷具有神經保護作用，其機制可能與增高GSH-Px、SOD活性、降低MDA含量抑制氧自由基損傷；降低NO含量、NOS活性，抑制神經毒性損傷；降低MPO活性、TNF-α、IL-1β含量抑制炎癥反應損傷有關。