異種生物材料應用于角膜移植的研究進展

靳 荷，鐘興武

(1.桂林醫學院附屬醫院眼科,廣西 桂林 541002； 2.中山大學中山眼科中心角膜科，廣州510060)

角膜病是常見的致盲性眼病，僅次于世界第一致盲性眼病白內障[1]。每年均有150萬～200萬新增角膜盲病例[2]。目前，仍有總數超1 000萬例的雙眼角膜盲患者[2]。而角膜移植一直是很多角膜病變的最有效解決方法。同種異體的角膜移植手術在治療角膜盲上取得了一定進展[3]。但近年來通過捐獻并能應用于臨床的角膜材料越來越緊張，很難滿足患者的需求。每年全世界僅能實施10 000臺角膜移植手術，而其中一部分移植手術后患者會因移植排斥反應和復雜炎癥反應而導致移植失敗[4]。

目前，各種人工生物材料和脫細胞生物材料的研發有助于在一定程度上緩解人類供體角膜的緊張情況。多項關于這些替代角膜材料的研究相繼被報道[5-7]。目前，大量關于豬眼角膜的移植實驗研究在一定程度上取得了很多研究成果[8-10]。現就異種材料在角膜組織中的應用進展及價值進行綜述。

1 角膜概述

1.1角膜的解剖結構及免疫特性 角膜組織在結構分為上皮細胞層、前彈力層、基質層、后彈力層和內皮細胞層，角膜基質內的膠原結構排列整齊，與角膜表面平行，平行排列的膠原結構能對進入眼的光線進行折射，減少散射。同時，角膜內皮細胞有“泵”的作用，通過Na+，K+-ATP酶活性維持房水和角膜Na+的梯度濃度，使角膜呈相對脫水狀態，是維持透明性的主要因素。同時，角膜組織沒有血管、淋巴等組織，使其在免疫反應中享有免疫豁免特權，相對于肝、腎、心臟等器官的移植，發生組織排斥的概率大幅度降低[11-12]，是其能夠實現異種移植的免疫基礎。供體植片經過處理后，能在解剖上和功能上實現成功是異種移植成功的主要原因，其中解剖和功能上的因素包括組織構建、角膜生物力學穩定性、細胞行為學、屈光力等，同時，這些因素也應與人類供體的相一致。目前，豬眼角膜被認為是一種具備替代人供體的生物替代材料之一。

1.2異種角膜移植材料的相關處理方式 近年來，各國研究者正在努力研究探尋一種安全、高效的移植材料來緩解角膜供體的緊張情況，同時也能降低手術移植排斥反應發生率。早在1987年McCarey等[13]研究采用氧化鉛玻璃植入手動機械刀切開的角膜基質層中，矯正無晶體眼所致的高度遠視，但出現了角膜植片壞死及植片排出等嚴重并發癥。之后有研究者將聚甲基丙烯酸甲酯材料、水凝膠材料等人工合成材料植入角膜基質中進行觀察，但均有中毒性角膜基質炎、植片排出、植片溶解等并發癥的報道[14-15]。人工合成材料的植片應用于角膜移植還有待改進，所以應用異種的脫細胞生物材料作為供體植片進行角膜移植開始受到關注。研究表明，脫細胞處理后的角膜材料可作為角膜組織再生的支架[16]。但有效通過化學或物理方法去除移植組織中的細胞成分，同時仍能保持組織的固有結構是目前的一大難題[17]。目前有很多脫細胞方法，包括凍干法、射線法、化學法、物理法等[18]。凍干法是常用方法[19]，此方法減少了物理及化學損傷，也減少了角膜組織蛋白變性[20]，但對移植后受體角膜基質細胞的遷移生長存在一定影響，術后的屈光矯正度數也存在一定問題[18]。應用化學法和物理法對角膜材料進行脫細胞處理后可能會因柔韌性變差而導致植片不能進行移植[21]。同時，此種脫細胞處理也可能會改變角膜基質的微環境，從而導致移植失敗[22]。

對于通過射線照射脫細胞方法，研究證實γ射線照射后可以顯著降低角膜的免疫原性，疾病傳播風險和植片被感染率[23]。雖然X線和γ射線的能量和發生機制不同，但兩者都是電磁波，均具備一定的組織穿透能力，在一定程度下均能引起組織內的細胞發生凋亡，所以生物學效應相同[24]。因為γ射線源于放射性元素的衰變，γ射線對組織的破壞性更強，在空氣中傳播幾乎不受影響[25]，所以γ放射源的管理非常嚴格。而X線廣泛應用于放療，使用更加安全、可控，來源也更方便。目前眼部X線的研究大多在于活體眼部腫瘤治療和對眼部正常組織保護性的研究[26]。因此，利用X線進行離體角膜脫細胞處理是一個全新的研究領域。

角膜基質主要由含細胞量相對較少的細胞外基質構成。平行的膠原纖維(主要是Ⅰ、Ⅴ型膠原纖維，后者約占20%)組成了250～400個膠原小薄板，而兩個鄰近的膠原小薄板的膠原纖維幾乎垂直[27]。正常的角膜結構和完整膠原排列組織是保持角膜透明性的必要條件[28]。當角膜結構不可逆的改變時，角膜的透明性也不會恢復[29-30]。目前很多研究在將異種植片處理后角膜的透明性均下降，然而X線或γ射線照射后發現角膜透明性無明顯改變，雖然在Masson染色中只能發現透鏡仍保持膠原結構，但用電鏡觀察透鏡中超微結構發現了膠原結構的改變。雖然透鏡的膠原結構發生了變化，變得稀疏，但并沒有影響透鏡的透明度，這也與Chae等[31]的研究結果相符，由于角膜基質中小直徑的膠原纖維增加，增加了纖維間距從而保持角膜的透明性。Stevenson等[23]和Gotoh等[32]研究發現，高劑量的射線可以減少胰島細胞的移植免疫排斥反應，而γ射線照射能減少角膜植片的變異源。X線和γ射線均對組織具有一定的穿透力，均能誘導組織中細胞凋亡。γ射線由于強大的放射能，對放射源管理非常嚴格。而X線波長較γ射線更長，X射線更加安全、可控，來源及臨床應用更廣泛。

1.3豬來源的異種角膜移植材料的限制因素 將異種脫細胞生物材料作為供體應用于角膜移植面臨的主要難題是人類供體與異種供體角膜厚度的統一，這就導致手術中很難進行邊緣的對齊與縫合，嫁接組織結構厚度的不統一將導致移植失敗。人類角膜的中央厚度平均為536 μm[33]，而豬眼角膜的中央厚度達到了659～995 μm，且不同年齡段豬眼角膜厚度差距也較大[34]。豬眼角膜在經過脫細胞處理和保存后水腫程度大大增加，對于中央角膜厚度的測量也存在很大誤差。Choi等[8]將脫細胞處理后的豬眼角膜移植到非人類靈長類動物(恒河猴)中，移植后植片中央角膜厚度減少了400 μm。因此他們指出，保存后的豬眼角膜厚度若在850 μm左右，則比較適合進行異種移植，能夠應用于人類受體的異種移植研究，但目前對于超過950 μm的豬眼角膜還正在進行相關的異種移植研究。

另一個異種角膜移植手術限制因素為角膜的生物力學。研究表明，豬眼角膜生物力學與人類非常接近，但柔韌性和黏性較人類低[35]。然而在非人類的靈長類動物實驗中，這樣的生物力學差距并沒有影響異種植片的存活率和長期的生物力學穩定性。豬眼角膜的屈光力為40 D，相較于人角膜的44 D可以作為接受異種移植的材料[35-36]。同時，豬眼角膜屈光力可以通過移植時調整植片大小與曲面弧度來增大屈光力，以達到接近人類供體的水平。

再者，角膜植片的透明性是視功能的重要需求，所以內皮細胞的密度和功能必須與人類供體的相似。雖然豬眼角膜的內皮細胞功能與人類的相似，具有“泵”的作用，使角膜呈相對脫水狀態，維持角膜的透明性，但豬眼角膜內皮細胞密度會隨年齡的增長而降低，也存在同種異體的差異，所以在選擇植片供體前應考慮豬的不同品種和年齡的差異[37]。

2 異種角膜移植的免疫學

具有良好的組織相容性的角膜供體植片是移植成功的基礎。雖然角膜是無血管、無淋巴管的組織，但在接觸到豬來源的抗原后仍會同時發生體液免疫和細胞免疫，從而誘導對異種來源的植片發生排斥反應[38]。在豬眼角膜中，抗原的分布情況已被很多研究證實，在上皮細胞層、基質層和內皮細胞層中均有不同的高濃度抗原存在[39-40]。靈長動物的血清能夠結合這些異種的抗原，產生抗原抗體反應，引起排斥，特別是在上皮細胞層和富含膠原組織的基質層這類反應更加明顯。但目前研究表明，在內皮細胞層沒有或僅有一小部分異種抗原能引起免疫反應[40]。脫細胞技術的應用使異種供體的抗原大幅度降低，從而降低了在活體動物實驗中這種異種抗原帶來的嚴重免疫抗原抗體反應[41]。目前，研究證實降低豬眼角膜中Gal和NeuGc兩種抗原的表達可以顯著降低人受體的抗原抗體反應[42]。但完全抑制這兩種抗原的表達是否可以提高豬眼角膜植片的存活率仍是一個值得探討的問題。

在體外研究中，體液免疫和細胞免疫均能引起α1,3 -半乳糖基轉移酶基因敲除來源的豬眼角膜中內皮細胞的免疫反應，與野生型來源的豬眼角膜相比，加入人來源的CD46因子可以顯著降低α1,3-半乳糖基轉移酶基因敲除來源的豬眼角膜中的免疫反應[42]。體外研究表明，來源于基因調控的豬眼角膜能夠減少T細胞對人受體的免疫反應[6]。這些研究說明，來源于α1,3-半乳糖基轉移酶基因敲除/CD46的豬眼角膜可以在一定程度上減少靈長類動物異種移植的排斥免疫反應。野生型來源的豬眼角膜能夠誘導體液免疫和細胞免疫，特別是針對一些高風險移植的手術患者(炎癥期或者新生血管增殖期)，這兩種免疫反應會更加強烈。因此，轉基因來源的豬眼角膜可能成為異種來源的角膜植片應用于臨床。在動物實驗中，非人類靈長類動物的異種角膜移植研究表明，各種豬來源的異種角膜植片并不會引起強烈的免疫反應，同時，體液免疫反應和細胞免疫反應均在異種植片排斥時發生[6,8,10]。

3 非人類靈長類動物異種角膜移植的動物模型的研究

Kim等[6]和Choi等[8]依照供體豬的種類、受體的種屬、免疫抑制和角膜移植技術多方面進行供體角膜生存率總體評估，研究發現經過處理的異種角膜供體(如脫細胞移植或脫水處理的植片)較新鮮的異種植片存活率更高。在應用類固醇激素治療中，使用異種角膜植片，前板層角膜移植較穿透性角膜移植術植片存活率更高。目前，無論使用基因工程豬還是實驗種屬豬來源的異種植片，在分別進行前板層異種角膜移植術后，異種植片的存活時間均沒有超過120 d。然而，選用野生型來源的豬眼角膜進行穿透性角膜移植，同時給予足夠的CD154抗體，可以達到超過6個月的植片存活率。總之，用新鮮的異種植片進行角膜異種移植仍需要使用大量的免疫抑制和類固醇激素[42]。

除解決異種移植的植片應用外，實現異種移植還有一個主要的障礙——手術方式的選擇。在鐘興武教授課題組的研究中，用小切口全飛秒激光輔助進行異種植片的移植，將兔和人的新鮮植片進行甘油凍存2周后，利用小切口全飛秒激光的輔助作用，做2 mm切口，將植片植入猴眼角膜的角膜層間[43]。在為期2年的觀察中，猴眼角膜植片保持透明，無植片溶解、植片脫出等現象發生[43]。這種手術方式利用飛秒激光輔助，可以在層間形成規則、可控、切削平面高度一致的層間切口，大幅度提高了手術效率。更重要的是，此種層間板層角膜移植手術方式使供體植片隔絕了角膜上皮淚液因子和內皮細胞的影響，在一定程度上減少了受體組織因手術的炎癥反應對植片的刺激，增大了植片的存活率。同時，植片的層間植入改變了受體角膜的體積和曲率，將角膜重新塑形，因為植片的屈光度數是可控的，所以這種增加性的屈光移植手術，不僅改變了角膜的體積還能改變整個眼前段的屈光狀態。該手術方式在單純移植方面，可以應用于角膜溶解、角膜擴張、圓錐角膜等基質層加固性手術，在屈光方面，可以應用于遠視、老視等研究。所以，小切口全飛秒激光輔助進行異種植片的移植這種手術方式是高效、預測性強、具有應用前景的手術方式。

4 展 望

近年來，很多關于脫細胞豬眼角膜的應用研究被相繼報道，其中，有進行手術方式改進后并成功降低異種植片免疫排斥反應的報道，也有在豬眼角膜脫細胞處理方式上改進后移植于人眼并移植成功的病例報道。在這些前驅研究的基礎上，關于豬眼角膜免疫工程學的研究及其相關法律、法規、倫理相繼進行專家研討后，豬眼角膜在不遠的將來可以在多方面應用于臨床，也將大幅度緩解臨床供體緊張的現狀，造福于更多角膜病患者，降低角膜盲的發病率。