HepaRG細胞在藥物代謝相關研究中的應用進展*

李洪芳，孫樹森，張濤，唐富山

(1.遵義醫科大學藥學院臨床藥學教研室，遵義 563006；2.遵義市臨床藥學重點實驗室，遵義 563006；3.美國西新英格蘭大學藥學與健康科學學院，馬薩諸塞 01119)

藥物代謝是在多種代謝酶參與下藥物結構的改變、藥理作用發揮或終止及毒性物質清除的重要體內過程，在藥物開發及臨床前預測藥物相互作用研究中具有重要的意義。在臨床實踐中藥物的藥動學相互作用可發生在藥物體內過程吸收、分布、代謝和排泄的任意環節，其中藥物代謝相關的相互作用發生率最高，可占藥動學相互作用的40%[1]，藥物代謝是臨床藥學領域的研究熱點之一。過去曾主要以嚙齒類動物及犬、猴等作為模型模擬人的體內環境研究藥物代謝，但種屬差異會影響實驗結果的參考價值[2]。原代人肝細胞(primary human hepatocytes，PHH)被認為是研究藥物代謝體外模型的金標準。但是分離的PHH存在細胞培養困難、早期表型改變、代謝酶活性維持時間短、供體間差異大等缺點，限制了其作為體外藥物代謝研究模型的實用性和可靠性[3]。人肝細胞HepG2細胞系是一種易獲得的體外藥物代謝研究模型，可用于胰島素抵抗模型研究及防治胰島素抵抗活性的中藥有效部位的篩選[4]，也用于研究藥物毒性作用及機制研究，但缺乏肝特異性功能[5]。HuH7細胞在早期用于藥物代謝和毒理學研究，該細胞也同樣缺乏相關的肝特異性功能[6]。HepaRG 細胞系是GRIPON等[7]在2002年對乙型肝炎病毒感染人肝癌細胞系研究中發現的，并首次從慢性丙型肝炎病毒感染的肝癌女性患者體內的非瘤組織分離出來的細胞株，在2%二甲亞砜(DMSO)存在下可分化為肝細胞形態和膽管樣結構，表現出與人肝細胞基本一致的功能，如藥物代謝CYP酶系及藥物蛋白轉運體等。當HepaRG 細胞高分化為肝樣細胞后，表達成熟肝細胞標志物——醛縮酶 B(aldolase B)，其mRNA 表達水平是新鮮分離人肝細胞的20%，而在HepG2細胞中則檢測不出[8]。大量研究表明HepaRG細胞是替代人肝細胞用于體外藥理學和毒理學研究的合適模型[9-10]。筆者主要綜述HepaRG細胞基于藥物代謝在體外模型構建、藥物代謝機制、藥物相互作用及毒理學等研究中的應用進展。

1 HepaRG細胞作為藥物代謝體外模型的研究進展

1.1HepaRG細胞作為藥物代謝體外模型比較優勢 HepaRG細胞在分化階段表達肝特異性功能(如CYP酶、轉運蛋白及核受體)是替代PHH研究體外藥物代謝的合適模型。在HepaRG細胞、人肝細胞和HepG2細胞中評估藥物代謝酶(CYP1A2、CYP2B6、CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4、尿苷5'-二磷酸葡糖醛酸基轉移酶[UGT]和磺基轉移酶[SULT])的活性研究中發現除了SULT外，HepaRG細胞中酶的活性與人肝細胞中相似，并且遠高于HepG2細胞中酶的活性；毒理學研究中也發現黃曲霉毒素B1和環磷酰胺對HepaRG細胞基因表達的影響比HepG2細胞中更顯著[11]。由HepG2細胞演化而來的C3A細胞與HepaRG細胞比較中發現HepaRG細胞表現出更多的器官表型，包括CYP3A4的表達，使用LC-MS/MS和HPLC對非那西丁(CYP1A2)和睪酮(CYP3A4)藥物的代謝物進行分析，結果顯示HepaRG細胞具有更為完整的藥物代謝酶[12]。此外，有研究者選擇14種具有導致肝損傷的藥物，分別處理L-02、HepG2、HepaRG和hiHeps 4種細胞后發現：HepaRG細胞中比其他3種細胞更能明顯觀察到氧化應激、線粒體損傷和脂質代謝紊亂的改變；天冬氨酸氨基轉移酶、乳酸脫氫酶和蘋果酸脫氫酶的升高均與雙氯芬酸鈉和鹽酸丁螺環酮導致的肝細胞毒性作用有關[13]，后者與臨床實踐中的結論一致。在上述的體外模型比較中HepaRG細胞表現出與體外人肝細胞在代謝酶表達甚至代謝效應方面更高的相似度，是體外藥物代謝與毒理學體外研究中相對而言更為合適的人肝細胞替代模型。

1.2對HepaRG細胞三維培養的探索 目前HepaRG細胞體外培養多數是在二維(2D)環境下，不能很好模擬藥物在人體內的處置環境，同時2D環境下體外培養的細胞模型也存在很多的缺陷。如2D環境下培養的PHH，它表現出明顯的功能變異、生命周期和生長活性的有限性及藥物轉運體活性降低[14]。因此需要在細胞水平上探索更接近人體內環境的體外藥物代謝模型。MALINEN等[15]使用納米原纖維素和透明質酸明膠水凝膠構建的三維(3D)培養支架培養未分化的HepaRG細胞，發現可誘導細胞形成肝細胞極性和功能性膽小管樣結構的3D多細胞球體即肝細胞標志物，并在3D多細胞球體的小管膜上發現肝膽藥物轉運蛋白MRP2和MDR1的表達。有文獻報道在3D旋轉生物反應器中培養HepaRG細胞模擬3D環境，并評估了CYP酶(CYP1A2、2B6、2C9和3A4等)和藥物轉運體UGT的活性，同時用HepaRG細胞測試藥物對乙酰氨基酚(APAP)的肝毒性，結果顯示酶活性及藥物的肝毒性與PHH的表現相似[16-17]。在眾多的模型研究中HepaRG細胞的分化都離不開高濃度DMSO的存在，而DMSO對藥物代謝研究是否存在影響尚不清楚。為此，有學者研究在DMSO不存在的藻酸鹽微囊化條件培養3D HepaRG細胞，觀察到HepaRG細胞中肝樣細胞與膽管樣細胞的比率達到了2.9：1；與2D培養環境相比，肝細胞分化改善了35.9%、白蛋白和氨基甲酰磷酸合成酶I的表達更高并具有極化的球狀體組織，有效擴展了HepaRG細胞的應用[18]。在半乳糖殘基-藻酸鹽支架中培養的HepaRG細胞也觀察到與文獻[18]類似的結論[19]。綜上所述，3D培養比2D培養更有利于促進HepaRG細胞的分化、改善細胞形態、肝標記物的表達及代謝酶的活性，3D培養的HepaRG細胞可模擬接近藥物在人體內肝臟對藥物的處置環境，是更適合于體外藥物代謝和新藥開發的研究模型，有關3D培養的材料和手段尚有待進一步研究開發。

2 HepaRG細胞在藥物代謝研究中的應用

HepaRG細胞在加有2%DMSO的培養基中分化為明顯的肝細胞形態和膽管樣結構，細胞開始融合時可穩定表達CYP1A2、2B6、2C9、2E1和3A4等酶活性，當HepaRG 細胞開始增殖分化成肝樣細胞時，藥物代謝酶的表達水平與PHH相似；但DMSO不存在時，HepaRG細胞中CYP3A4的表達水平迅速降低，CYP1A2，CYP2B6和CYP2C9的表達也可觀察到類似的結果[3，8]。HepaRG細胞中CYP酶的表達和活性可維持超過4周，并發現CYP1A2、CYP2B6和CYP3A4可被奧美拉唑、苯巴比妥和利福平等酶誘導劑所誘導[20]。LUBBERSTEDT等[21]評估PHH和HepaRG細胞的肝細胞特異性參數，結果顯示半乳糖/山梨糖醇消除速率和白蛋白的產生在HepaRG細胞中更高。HepaRG細胞在早期分化過程中就表達一些肝特異性CYP酶，如CYP4F3B、CYP4A11、CYP4F2和CYP4F12，這些酶能通過下調脂質代謝基因調節因子的表達參與脂肪代謝，當用飽和、單不飽和或多不飽和脂肪酸處理HepaRG細胞時，CYP4F3B和CYP4A11表達保持不變，而CYP4F2和CYP4F12的表達上調[22]。藥物的代謝不但涉及I相藥物代謝酶，還需II相藥物代謝酶的參與。有文獻已經報道在分化的HepaRG細胞中谷胱甘肽轉移酶GSTA1/A2、 GSTA4、 GSTM1、UGT1A1和UGT2B7的mRNAs表達水平與PHH相似，此外各種核受體如芳香烴受體(AHR)、孕烷X受體(PXR)、組成型雄甾烷受體(CAR)及過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator activated receptor α，PPARα)也有相似的表達[23]。硫丹和甲氧氯是PXR和CAR兩種核受體的激活劑[24-25]，它們的主要代謝途徑涉及CAR和PXR調節的CYP3A4和CYP2B6酶[26]。使用硫丹和甲氧氯處理HepaRG細胞發現兩種化合物均增加CYP3A4和CYP2B6 mRNA水平，也能與人肝細胞中的其他外源性物質相互影響[27]。用利福平處理HepaRG細胞后，利福平誘導的CYP3A4、2B6和2C9加快美托洛爾的α-羥基化，O-去甲基化和N-脫烷基化，由此證實參與美托洛爾代謝并非只有CYP2D6酶，同時也解釋在人體內觀察到利福平治療后美托洛爾和α-OH-美托洛爾比率的降低[28]。藥物代謝酶CYP3A4是臨床上絕大多數藥物的代謝酶之一，也被認為參與了生物毒素岡田酸(OA)的代謝。在沒有CYP3A4抑制劑的情況下，用OA處理HepaRG細胞系可檢測出兩種單羥基化的代謝產物，而在CYP3A4抑制劑存在的情況下則檢測到代謝產物，此研究表明CYP3A4激活時OA的細胞毒性降低，而羥基化是OA代謝的關鍵環節[29]。

3 HepaRG細胞在藥物相互作用研究中的應用

在臨床實踐中聯合用藥是很常見的，這導致藥物與藥物、藥物與食物之間發生相互作用的機會增加，其中藥物對相關代謝酶如CYP酶的誘導或抑制被認為是藥物發生相互作用的重要因素。HepaRG細胞是替代PHH體外藥物代謝研究的合適模型，已有文獻報道HepaRG細胞模型用于藥物代謝相關的藥物相互作用研究。用利福平和苯妥英作為誘導劑及胺碘酮作為底物，該研究首次用HepaRG細胞作為體外藥物代謝模型驗證了利福平和苯妥英是胺碘酮的強誘導劑[30]。PXR和CAR兩種核受體調節CYP酶表達導致的藥物相互作用越來越受到人們的關注。在臨床上常用的甲硝唑與華法林聯合用藥導致患者腦出血或凝血酶原時間延長被認為是甲硝唑增加華法林的血藥濃度[31-32]。使用甲硝唑和華法林處理HepaRG細胞后發現CYP2C8、CYP2C9、CYP3A4和CARmRNA的表達水平降低，該研究結果表明甲硝唑通過下調調節CYP2C9表達的核受體CAR，而導致其mRNA表達水平的降低[33]。HepaRG細胞中存在轉錄因子CAR、PXR、PPARα、AHR、類視黃醇X受體(RXR)及CYP酶可作為體內CYP誘導預測的體外模型。文獻報道在HepaRG細胞中CYP3A4、2B6和2C9被利福平誘導后美托洛爾代謝加快，表明利福平誘導這些酶的活性。此外，HepaRG細胞中CYP2B6、CYP1A2和CYP3A4的活性也可分別被苯巴比妥、奧美拉唑及利福平所誘導，跟臨床實踐中的結論一致[28，34]。冬凌草甲素是從植物冬凌草葉子中提取的二萜類化合物，具有抗腫瘤活性和抗氧化功能而被廣泛應用，但對CYP450s mRNA和蛋白質表達的影響乃不清楚。據報道，用冬凌草甲素處理HepaRG細胞系后發現其能夠誘導CYP3A4和CYP2C9酶的活性及mRNA水平增加的作用[35]，該研究結果提示在臨床上應謹慎使用以避免潛在的藥物相互作用。HepaRG細胞還可以應用于蘆葦提取物改善多西他賽誘導的骨髓毒性作用的研究，但是其具體的活性成分和機制尚需進一步的研究[36]。

4 HepaRG細胞在藥物代謝相關毒理研究中的應用

4.1在藥物肝毒性研究中的應用 肝臟是人體重要的解毒器官，藥物經過肝臟代謝后可使藥物代謝活性增強、前體藥物藥理作用激活和毒性物質產生等，某些藥物的肝毒性與其在肝臟中的代謝密切相關。過去對乙酰氨基酚(APAP)肝毒性的機制研究較多，但大多數都是用嚙齒動物模型和PHH進行肝損傷的機制研究，其中嚙齒類動物與人類之間存在種屬差異，不能準確預測藥物在人體內的肝損傷機制。當用不同濃度APAP處理HepaRG細胞后，發現細胞中的APAP-蛋白質結合物形成、細胞溶質鈣升高、線粒體氧化應激和過氧亞硝酸鹽形成、線粒體功能障礙和乳酸脫氫酶(LDH)釋放及谷胱甘肽化導致的能量代謝缺失，而LDH釋放的時間過程與APAP在人體過量后血漿氨基轉移酶活性的增加類似[37]，該研究的結論驗證了APAP在人體內肝毒性的機制，同時也提出了一些新的見解，而谷胱甘肽化的機制則是繼發于共價結合[38]。戊唑醇是三唑類殺菌農藥，在嚙齒動物研究中發現可引起肝毒性，在體外HepG2和HepaRG細胞中對戊唑醇毒性的分子機制研究發現戊唑醇可通過激活AHR受體誘導CYP1A1和CYP1A2的表達[39]。以牛磺酸處理HepaRG細胞的研究發現細胞的粘附力明顯下降、細胞死亡和裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3顯著增加，表現出一定的劑量依賴性；并且大劑量應用牛磺酸還能致使血清谷氨酸脫氫酶和白細胞介素(IL)-6的分泌增加，這表明牛磺酸可以引起對肝細胞的直接毒性作用導致肝損傷[40]。

4.2在細胞毒性及遺傳毒性研究中的應用 藥物經肝臟代謝后可能會產生毒性或毒性物質直接損傷細胞，這也是藥物開發和臨床合理用藥要考慮的重要問題。用蘆薈大黃素處理HepaRG細胞后可致細胞中活性氧(ROS)產生，線粒體膜電位去極化，線粒體細胞色素C釋放，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3、-8和-9裂解，Fas、p53、p21表達水平和Bax/Bcl-2比值增加；此外它還通過增加p21和細胞周期蛋白E的表達誘導細胞停滯于S期和降低細胞周期蛋白A及細胞周期蛋白依賴性激酶2(CDK2)的表達，從而以劑量和時間依賴性方式降低HepaRG細胞的活力和誘導其凋亡[41]。海洋單細胞藻類的代謝產物親脂性貝類毒素(OA、DTX-1、DTX-2和PTX-2等)會導致嚴重的食物中毒。在HepaRG細胞實驗發現這些貝類毒素能夠誘導細胞凋亡和DNA鏈斷裂具有很強的細胞毒性，尤其是PTX-2和DTX-1還誘導HepaRG細胞中CYP3A4增加基因毒性標記物水平[42]。HepaRG細胞在毒理學研究中廣泛用于肝毒性、細胞毒性及遺傳毒性等的研究，可用于臨床藥物毒性的篩選。

5 HepaRG細胞基于藥物代謝的其他應用

HepaRG細胞在藥物膽汁淤積及磷脂過多癥等研究中已有一定的報道。BURBAN等[43]以HepaRG細胞研究發現3種耐酶青霉素均可引起細胞膽汁淤積，其機制主要與依賴早期內質網應激觸發的ROS產生及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3活性的增強有關。其他學者也以HepaRG細胞研究了波生坦、環孢素、氯丙嗪和曲格列酮等具有相似的藥物膽汁淤積機制研究[44-45]。藥物導致磷脂過多癥臨床常見，用氯雷他定處理HepaRG細胞，發現氯雷他定代謝物的激活會導致磷脂在細胞中沉積[46]。法呢醇(FOH)可調節脂質代謝和降低嚙齒類動物肝臟三酰甘油含量，用FOH處理脂肪肝HepaRG細胞模型發現它通過增加脂肪酸氧化降低細胞中的三酰甘油含量，并推測可能是PPARα受體介導的線粒體脂肪酸氧化誘導[47]。

6 結束語

HepaRG細胞具有表達I相藥物代謝酶CYP酶、Ⅱ相藥物代謝酶、轉運蛋白及核受體等肝特異性功能的潛力。在DMSO存在下分化為肝樣細胞和膽管樣細胞并穩定表達CYP1A2、2B6、2C9、2E1、3A4等酶活性及肝特異性標記物，其CYP酶的mRNA表達水平與PHH相似，能在體外于較長時間內保持酶活性及蛋白轉運體功能，被廣泛認為是替代PHH用于體外藥物代謝相關的藥物代謝機制、藥物相互作用及毒理學等研究的合適模型。但HepaRG細胞培養中所需的高濃度DMSO、細胞培養周期長以及該細胞的來源性別是否會影響細胞模型基因的表達，目前的研究尚無共識，需要深入研究[48]，三維培養也許是部分解決DMSO問題的途徑之一；另外關于藥物相互作用在HepaRG細胞中應用的文獻報道較少，且多是驗證性研究，需要進一步系統研究。