丹參酮ⅡA和Notch信號通路與腎纖維化的研究進展

張力之，李 均

(遵義醫學院珠海校區中藥應用與基礎研究重點實驗室，廣東 珠海 519000)

腎纖維化是腎組織受損后人體自身修復的結果，也是各種慢性腎臟病發展到終末期腎病的共同通路[1]。近年來，腎纖維化進程中腎小管上皮-間充質轉化(epithelial mesenchymal transition，EMT)逐漸受到關注，其進展速度直接影響腎纖維化進程。丹參的脂溶性成分丹參酮ⅡA被廣泛用于腎纖維化的臨床治療，對改善腎臟纖維化和保護腎臟功能的效果明顯。丹參酮ⅡA可通過干預EMT進一步影響腎纖維化的產生與進展，具體過程可能與多條導致腎纖維化的信號通路有關。Notch信號通路是近年來信號通路的研究熱點，與腎纖維化關系密切[2]。阻斷Notch信號通路可抑制EMT、減少肌成纖維細胞的生成，并可進一步減緩腎臟組織纖維化的進展[3]。但丹參酮ⅡA與Notch信號通路之間的關聯性及具體影響機制仍需進一步深入探討。現對丹參酮ⅡA和Notch信號通路與腎纖維化的研究進展予以綜述。

1 Notch信號通路與腎纖維化

1.1Notch信號通路概述 Notch信號通路是由多種信號分子參與的高度保守的信號通路，廣泛存在于各種生物進化過程。Notch信號通路由Notch受體、Notch配體、細胞內轉錄因子CSL(C-啟動子結合因子1/重組信號結合蛋白-Jk、無毛抑制器、滯后蛋白1的合稱)、效應物及相關調節分子等組成，參與調控細胞增殖、分化、凋亡等關鍵環節，并精確調節細胞之間的信息交流[4]。目前，存在于人體內的Notch受體有Notch1～Notch4，其中Notch1～Notch3常表達于神經和心臟、腎臟、肝臟等，Notch4則表達于上皮細胞[5]。Notch受體由細胞外區、跨細胞膜區、細胞內區3部分組成，細胞外區由表皮生長因子重復序列以及含半胱氨酸的Lin/Notch重復序列組成，能夠識別并結合Notch配體，并激活信號途徑；細胞內區由錨蛋白重復序列、含谷氨酰胺的結構域以及PEST結構域組成，通過將Notch信號轉導至細胞核內部來調節細胞的生命活動。目前，明確的人體內跨膜蛋白Notch配體是Jagged1、Jagged2、Delta-like 1、Delta-like 3、Delta-like 4，可在信號通路激活后結合Notch受體，經過兩次蛋白裂解，形成Notch蛋白胞內活化域，隨后進入細胞核結合細胞內轉錄因子CSL，激活通路下游的Hes-1、Hey等靶基因，使蛋白產物大量表達，調控細胞周期，影響細胞的增殖、分化和凋亡[6-10]。

1.2腎小管EMT 腎小管EMT與腎纖維化關系密切。EMT導致組織中成纖維細胞增多，成纖維細胞發生功能和表型改變，轉變為表達α平滑肌肌動蛋白的肌成纖維細胞，從而產生大量的細胞外基質，促使腎纖維化的產生[11]。與腎小管EMT相關的常見因子有轉化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)、成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、結締組織生長因子等。上皮鈣黏素被認為是EMT的特征性蛋白，細胞內上皮鈣黏素含量降低是EMT發生的特異性標志[12]。在EMT過程中，細胞上皮鈣黏素減少，大量間充質蛋白出現(如α平滑肌肌動蛋白、波形蛋白等)，使細胞黏附能力下降，導致大量上皮細胞遷移，加速肌成纖維細胞生成。鋅指轉錄因子是EMT過程的關鍵分子，細胞中鋅指轉錄因子蛋白含量增加可導致上皮鈣黏素的表達下降，從而加重纖維化[13-14]。

1.3Notch信號通路與腎間質纖維化 Notch信號通路可通過調控腎臟組織細胞的增殖、發育、凋亡等影響腎間質纖維化的發生。Notch信號通路參與腎小管EMT過程可能與許多信號通路(TGF-β信號通路、Wnt信號通路、表皮生長因子受體信號通路、血管內皮生長因子信號通路等)相關，通過影響EMT過程中上皮鈣黏素、鋅指轉錄因子及相關調控因子等影響腎纖維化過程。在腎小管上皮細胞EMT過程中,Hey1基因受TGF-β和Jagged1共同調控，TGF-β可以參與誘導早期Hey1基因的表達,Jagged1則調控后續Hey1基因的表達。Hey1基因激活可引起信號通路下游目的蛋白大量表達，減少細胞間黏附力，加快EMT的進展，可見，Notch信號通路可與TGF-β信號通路協同串聯，共同調控腎小管上皮細胞的EMT過程[15]。Aoyagi-Ikeda等[16]通過細胞實驗發現，細胞纖維化時，Notch信號通路的激活是TGF-β誘導纖維化細胞產生α平滑肌肌動蛋白以及生成細胞外基質的必備過程。當Notch信號通路激活后，配體Jagged1表達產物大量增加，導致大鼠上皮細胞中α平滑肌肌動蛋白過量表達，細胞纖維化加重。腎間質纖維化病理改變中，TGF-β1可增加Notch1、Notch4、Jagged1、Jagged2等基因的表達，從而調控EMT產生[17-18]。TGF-β信號通路下游分子Smad3可通過與Notch信號通路下游細胞內轉錄因子CSL的結合影響信號通路的轉導[19]。具體過程可能是TGF-β活化后，促進Notch信號通路中HES-1蛋白表達，此過程可被CSL阻滯，Notch蛋白胞內活化域及Smda3發生效應后形成多聚物，調節HES-1蛋白表達。當CSL與Notch蛋白胞內活化域共存時，Smad3可與CSL結合，進而取代DNA上CSL/Notch蛋白胞內活化域靶點[20]。Bielesz等[21]研究認為，Notch信號通路可以加快TGF-β信號通路中Smad3的活化過程，Smad3能夠增加結締組織生長因子的表達，抑制上皮鈣黏素表達，同時提高細胞內α平滑肌肌動蛋白的表達，進而促進EMT的發生，加重腎間質纖維化程度[22]。3，5-二氟苯乙酰-L-丙氨酰-S-苯基甘氨酸t-丁酯{N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-Butyl Ester，DAPT}是Notch信號通路細胞內因子γ分泌酶抑制物，通過降低Notch信號通路活性，抑制Notch蛋白胞內活化域和HES-1的表達，阻斷Notch信號通路的活化，進而抑制大鼠腎小管上皮細胞間質轉化[23]。進一步研究發現，Notch信號通路與TGF-β1信號可在腎間質纖維化過程中互相影響，γ分泌酶抑制劑能阻斷TGF-β1調控的近端腎小管上皮轉分化過程，TGF-β1及轉分化有關基因均被γ分泌酶抑制劑所抑制，腎間質纖維化過程受到影響，表明阻斷Notch信號通路后，TGF-β1信號通路也會被阻斷，腎小管上皮細胞EMT過程將會受到抑制[24]。此外，當Notch信號通路被激活后，鋅指轉錄因子蛋白大量表達，從而促進TGF-β1介導的EMT發生，并加重纖維化，表明Notch信號通路和TGF-β1信號通路存在協同作用，可以共同調控組織纖維化[25-26]。同樣，Notch信號通路與Wnt信號通路、血管內皮生長因子信號通路也存在類似的聯系。朱天琦等[27]研究發現，Notch信號通路抑制劑作用于人腎母細胞瘤細胞后，Notch信號通路中Notch1和Jagged1以及Wnt信號通路中Wnt1和β聯蛋白表達都明顯降低，還發現DAPT可抑制細胞中血管內皮生長因子的表達。Lin等[28]研究發現，糖尿病腎損傷細胞模型中足細胞、人胚腎細胞(HEK293)以及動物模型腎組織中均可檢測到Notch信號通路的過表達，這可能與血管內皮生長因子等因素有關。

其他器官組織的EMT過程也有Notch信號通路參與調控細胞組織的纖維化。肝臟纖維化的研究證實，DAPT能夠延緩大鼠肝臟EMT的發生，改善肝臟細胞纖維化[29-30]。一方面，DAPT干預治療大鼠肝星狀細胞內Notch信號通路活性降低，信號轉導被抑制；另一方面，TGF-β、鋅指轉錄因子和間質細胞表達產物生成減少。DAPT可上調上皮鈣黏素的表達，上皮鈣黏素表達增加可減慢細胞發生EMT的速度。肝臟損傷模型中Notch和Hedgehog信號通路可通過介導EMT共同調控肝星狀細胞。肝星狀細胞中Notch信號通路與Hedgehog信號通路同時被激活，Hedgehog信號通路激活后，可進一步促進Notch信號通路的信號轉導。當特定阻斷Notch信號通路后，細胞內Hedgehog靶基因Gli1和Ptc表達產物減少,Hedgehog信號通路轉導被抑制。阻斷Hedgehog信號通路中Smoothened發現，細胞內Notch2、Jagged1以及Notch信號通路的靶基因表達下降，說明肝纖維化過程中Notch信號通路和Hedgehog信號通路共同參與肝星狀細胞的EMT，且兩者之間可相互影響，共同決定EMT的發展進程[31]。肺纖維化過程中使用DAPT可以抑制Notch信號通路活化，降低解整合素金屬蛋白酶17的表達，減少局部活性氧類的產生，降低肺組織氧化損傷，從而改善肺纖維化程度[32]。于秀文和曾林祥[33]阻斷Notch信號通路轉導發現，肺組織中肌成纖維細胞生成受到抑制，肺纖維化進程得到緩解。可見，Notch信號通路與組織纖維化關系密切，激活Notch信號通路可導致組織細胞EMT的產生，促使纖維化的發生。

2 丹參酮ⅡA和Notch信號通路與腎纖維化

2.1丹參酮ⅡA與腎纖維化 丹參酮ⅡA又稱丹參醌Ⅱ或丹參醌ⅡA，分子式為C19H18O3，是一種橘紅色針狀結晶，熔點209～210 ℃，主要存在于丹參的干燥根和根莖，易溶于有機溶劑，微溶于水。近年來，隨著對丹參脂溶性成分丹參酮ⅡA的深入研究，發現丹參酮ⅡA能夠抗炎抗氧化，同時能明顯抑制成纖維細胞增殖，減少細胞外基質產生，延緩腎間質纖維化過程，改善腎組織纖維化。丹參酮ⅡA可以抑制纖維連接蛋白、膠原蛋白Ⅲ、膠原蛋白Ⅳ和腫瘤壞死因子α、單核細胞趨化蛋白1和CXC趨化因子配體1的蛋白質以及信使RNA的表達，同時可以抑制5/6腎切除大鼠腎組織中TGF-β/Smad和核因子κB信號的激活，從而進一步抑制腎臟組織EMT的產生[34]。趙斐等[35]研究證明，丹參酮ⅡA能夠維持腎小管上皮細胞形態的穩定，防止細胞向成纖維細胞發展，并在一定程度上抑制TGF-β1誘導的細胞增殖和分泌Ⅰ型膠原的作用，從而達到防治腎纖維化的目的。唐錦輝和占成業[36]的研究發現，丹參酮ⅡA能夠起到延緩腎間質纖維化和保護腎臟功能的作用，與下調細胞內TGF-β1的表達、抑制成纖維細胞生成和轉化以及減少相關膠原蛋白的產生等密不可分；通過丹參酮ⅡA的干預發現，干預組腎間質纖維化程度比模型組減輕，腎組織中TGF-β1、α平滑肌肌動蛋白和Ⅰ型膠原蛋白的表達均下降。王俏等[37]建立丹參酮ⅡA干預治療糖尿病腎病大鼠模型的研究發現，丹參酮ⅡA具有保護腎臟和延緩糖尿病腎病進展的作用，具體功效可能與丹參酮ⅡA強大的抗氧化活性有關；細胞組織中總抗氧化能力、谷胱甘肽過氧化物酶表達、超氧化物歧化酶活性可隨丹參酮ⅡA的使用提高；與此同時，丙二醛總量有所下降，腎小球基膜增厚和硬化得到改善，腎纖維化程度得以減輕。丹參酮ⅡA磺酸鈉作為丹參酮ⅡA磺酸化后產物，具有良好的溶解性以及抗纖維化和改善循環等功效，常用于臨床治療。丹參酮ⅡA磺酸鈉能夠下調血小板源性生長因子D，并上調血紅素加氧酶1的表達，抑制間質細胞增生和表型轉化，從而抑制大鼠腎間質纖維化的產生和進展[38]。周儒兵等[39]通過丹參酮ⅡA磺酸鈉干預糖尿病大鼠的實驗發現，丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液治療組α平滑肌肌動蛋白、波形蛋白和TGF-β1的表達均較糖尿病模型組下調，且腎間質纖維化程度得到改善。唐云海和朱春玲[40]認為，波形蛋白可能參與促炎反應和促腎間質纖維化過程。丹參酮ⅡA磺酸鈉可通過降低波形蛋白在腎小管間質的表達減少細胞外間質的生成，從而緩解腎間質纖維化。

除腎纖維化外，丹參酮ⅡA對其他器官和組織也有抗纖維化作用。對肺纖維化的研究發現，丹參酮ⅡA不僅可通過減少肺間質纖維化期間炎性細胞的產生和炎性因子的釋放來減少肺組織局部氧化應激反應，抑制誘導型一氧化氮合酶和環加氧酶2的表達；還可通過抑制大鼠TGF-β1、Smad2和Smad3信號途徑轉導，抑制肺間質纖維的產生[41]。對肝臟組織纖維化大鼠的研究發現，丹參酮ⅡA可通過抑制肝纖維化組織血管新生的方式起到抗肝纖維化作用，其關鍵環節是抑制肝組織血管內皮生長因子與缺氧誘導因子1α的信使RNA與蛋白的表達[42]。對心肌纖維化大鼠的研究發現，丹參酮ⅡA能夠抑制心肌間質成纖維細胞向肌成纖維細胞分化，通過下調結締組織生長因子的合成，減少心臟肌成纖維細胞中Ⅰ型和Ⅲ型膠原合成，從而明顯降低心肌間質膠原沉積，改善心肌纖維化程度[43]。

2.2丹參酮ⅡA與Notch信號通路 Notch信號通路與腎纖維化有直接關聯，丹參酮ⅡA通過調節各信號通路以及各環節細胞因子和蛋白產物對腎纖維化起保護作用。目前，丹參酮ⅡA調節Notch信號通路影響腎纖維化發生的具體調節機制尚不清楚。將大鼠隨機分為正常組、模型組、丹參酮ⅡA組、DAPT組及丹參酮ⅡA聯合DAPT組(聯合給藥組)的丹參酮ⅡA配伍DAPT抗大鼠腎纖維化的研究顯示，各單一給藥組和聯合給藥組大鼠腎組織纖維化程度較模型組輕；免疫組織化學結果顯示，各給藥組Notch蛋白胞內活化域、Hey1平均光密度值明顯低于模型組，以聯合給藥組效果最佳；蛋白質免疫印跡結果顯示，各給藥組重組信號結合蛋白-Jk、ColⅠ蛋白相對表達較模型組明顯降低，聯合給藥組效果最為明顯，由此可見，丹參酮ⅡA可緩解腎間質纖維化過程中膠原纖維的合成,其作用機制可能與抑制Notch蛋白胞內活化域、重組信號結合蛋白-Jk、Hey1在腎組織表達以及影響Notch/Jagged信號途徑轉導相關[44-45]。但丹參酮ⅡA是否能夠促進DAPT抑制Notch信號通路激活，從而協同延緩RIF產生的具體機制尚不明確。何瓊笑和趙峻峰[46]隨機將大鼠心肌缺血再灌注模型分為模型組、丹參酮ⅡA組和DAPT組，結果顯示模型組心肌內活性氧類水平和乳酸脫氫酶含量顯著升高，Notch1、Hes1、缺氧誘導因子1α的信使RNA和蛋白的表達明顯增高，與模型組相比，丹參酮ⅡA組和DAPT組中Notch1信使RNA的表達以及Notch1、Hes1和缺氧誘導因子1α蛋白的表達明顯下降，認為丹參酮ⅡA通過抑制Notch信號通路進一步調控抗氧化應激反應，從而對大鼠心肌缺血再灌注損傷起到保護作用。

3 小 結

目前，對丹參酮ⅡA與腎纖維化的研究主要集中在Wnt/β聯蛋白、TGF-β/Smad、缺氧誘導因子1α/血管內皮生長因子等信號通路。丹參酮ⅡA能夠參與以上信號轉導途徑，并減輕腎纖維化程度，延緩腎纖維化產生，保護腎臟功能。在腎纖維化過程中，Notch信號通路與以上信號通路相互串聯，但目前國內外對丹參酮ⅡA是否能夠參與Notch信號通路調節腎纖維化以及其具體調節機制尚不清楚。其他器官組織中，丹參酮ⅡA能通過調節Notch信號通路影響細胞生長、凋亡等。目前，有關丹參酮ⅡA與Notch信號通路及其通路信號因子在腎纖維化過程中具體關聯的研究正在進行。丹參酮ⅡA對腎纖維化過程中Notch信號通路具體調控機制的深入研究，有助于進一步闡述丹參酮ⅡA抗腎纖維化的作用機制，為丹參酮ⅡA臨床治療慢性腎臟病提供更多的理論依據。