膝關節骨性關節炎動物建模研究進展

張 晨，宋國瑞，劉子歌，陳德勝

(1.寧夏醫科大學臨床醫學院，銀川 750004；2.寧夏醫科大學總醫院骨科，銀川 750004)

目前90%以上膝關節骨性關節炎(knee osteoarthritis,KOA)病例臨床確診時已為中晚期，癥狀、體征明顯，關節軟骨退化嚴重，關節腔內周圍組織病損多，且多數已不可逆[1]。現階段，臨床上治療手段仍以手術為主，每年消耗了大量的社會、醫療和經濟資源[2]。有專家提出，如果在KOA病變早期即能及時發現并進行干預治療，則極有可能早期阻斷KOA的軟骨退行性變進程，甚至逆轉退行性變進程，從而徹底改變目前KOA臨床治療的被動局面[3]。目前KOA常用的動物模型有誘導型動物模型、自發性動物模型、轉基因型動物模型等。現介紹近年來成功建立KOA的建模方法，包括關節石膏制動法、Ilizarov外固定法、關節撞擊法、關節腔內瘦素注射法、基因敲除法等，從誘導型動物模型、自發型動物模型、轉基因型三大建模類型進行綜述，對比各類建模方法的特點，以期對KOA的診療、研究有所指導。

1 誘導型動物模型

誘導型動物模型即通過生物、物理及化學因素作用于動物，使動物產生類似于人類的疾病改變。人為干預誘導KOA動物模型建立的一般方法，包括關節制動、關節撞擊、關節內藥物注入、手術方法等[4]。

1.1關節制動法 關節制動產生的機械應力缺失是造成軟骨修復障礙的重要因素之一[5]。雖然在臨床常規治療上，早期制動對創傷骨折及運動性肌肉損傷患者急性期有應激保護的作用,可以減輕組織炎癥反應。但同時軟骨細胞中的壓力感受器控制著軟骨細胞功能的調節,參與細胞外基質穩態的維持，長期的應力缺失會破壞這種穩態,導致細胞生物活性和基質生成減少,軟骨膠原網破壞,促進破骨細胞形成，造成關節骨質以及軟骨細胞退行性變[6]。而關節退行性變也會根據制動方法的不同而產生差異，目前運用較多的關節制動方法有石膏固定法、新型外固定支具(聚丙烯板材制作)、Ilizarov外固定器等。

1.1.1石膏固定法 最經典的關節制動就是Videmen造模法，通過傳統管型石膏固定兔膝的伸直位，但是存在支具脫落、動物關節磨損等很多缺陷[7]。擺雪等[8]用石膏固定兔的膝關節屈曲位后，在石膏外層以鐵絲固定，成功取得骨性關節炎動物模型。該方法雖然經濟實惠，但未能有效防止支具被動物啃咬而導致的脫落，且外層鐵絲的固定容易造成石膏內部不平整，增加石膏與關節面的摩擦，促進關節炎癥反應，影響實驗結果。吳清洪等[9]采用內層應用厚棉墊鋪墊，外層鋪普通石膏后，最外層鋪設高分子聚乙烯材料的方法建立骨性關節炎動物模型，避免了因關節與石膏磨損產生炎性細胞對實驗結果的影響，成功預防了動物本能對支具啃咬導致石膏啃脫而影響實驗結果，值得借鑒。

1.1.2新型外固定支具 在新型外固定支局實驗中，張勁等[10]嘗試用絕緣塑料膠帶纏繞兔的踝關節后，再用聚丙烯材料制成的新型外固定支具前后固定兔膝大腿于伸直位，6周后取活組織病理檢查，觀察到KOA表現，證實建模成功。相比常規石膏固定法，此法有效規避了傳統死板的石膏固定造成的兔下肢腫脹、固定部位毛皮脫落以及爪部局部充血紅腫發炎等并發癥，而且新型支具嘗試性借助絕緣塑料膠帶的黏附性使其固定于動物毛皮，支具固定的位置距關節也保持一指距離，便于安裝、拆卸的同時，其舒適松軟的環境也不會機械性地壓迫兔膝關節，對兔的肛門造成應力摩擦的減小也減少了肛門潰爛的發生，改善了實驗動物的生活質量，提高存活率，值得借鑒。

1.1.3Ilizarov外固定器 Ilizarov技術，即在細鋼針穿骨后造成的張力下固定關節的環形固定器，最早由俄羅斯外科醫師Ilizarov于20世紀60年代提出[11]。Ilizarov技術中涉及的絕大部分操作是微創操作，切口小，其細針的插入降低對骨周圍組織，如軟組織、骨膜、骨髓等組織的侵襲，有效規避了關節周圍組織炎癥對KOA動物模型的影響[12]。其細針牽張后的關節腔既能保持較強的穩固性，又能滿足骨生長所需的微動。Dehghan等[13]將Ilizarov固定環固定于豬膝關節上、下5 cm處，固定環間隙略小于正常生理值，以保持關節面負重。在固定環分別鉆入2根1.5 mm克氏針，固定環之間用延長棒固定，將每個平面的克氏針針尖角度控制在10°～20°，8周后取活組織病理檢查，可見膝關節軟骨退化等骨性關節炎典型表現。

1.2關節撞擊法 許多實驗專家提出，雖然機械制動法、手術造成關節失穩等方法均能造成骨性關節炎，但是與臨床上創傷引起的關節退行性變的機制并不太相符。Redler等[14]設計了關節撞擊軟骨模型，他們應用垂直撞擊架，垂直撞擊兔的股骨內側髁，撞擊時間>12周，造成股骨關節不同程度損傷，病理切片發現軟骨損傷機制與臨床軟骨退行性變病理損傷機制類似。Mrosek等[15]用“落塔”微重力裝置對12支發育正常的實驗犬的髕骨關節進行撞擊，24周后對撞擊區進行活組織取樣檢查，結果表明有明顯軟骨基質退行性變，呈早期骨性關節炎表現。

1.3關節腔內藥物注射

1.3.1木瓜蛋白酶 木瓜蛋白酶本質是一種蛋白水解酶，其對關節基質的蛋白多糖有分解作用，并能消耗軟骨細胞膜上有絲分裂抑制因子，加快關節基質退行性變[16]。ükür等[17]將4%木瓜蛋白酶注入小鼠關節腔內，4周后對實驗組進行關節軟骨組織學檢查，結果顯示木瓜蛋白酶作用關節表面呈不規則化、纖維化，關節軟骨減少，出現早期KOA表現。汪宗保等[18]將混有木瓜蛋白酶的L-半胱氨酸注入大鼠關節腔內，并通過新型環境掃描電鏡發現大鼠關節出現早期骨性關節炎表現，該研究還發現，運用新型環境掃描電鏡可早期發現骨性關節炎變化，有助于KOA的早期研究。

1.3.2碘乙酸鈉 碘乙酸鈉又稱碘醋酸鈉，是甘油醛-3-磷酸脫氫酶的抑制劑，能引起軟骨基質的退行性變、軟骨細胞的降解和丟失、滑膜炎性改變等，其引起的關節病變與人類骨關節炎性變病理機制相似[19]。張文強等[20]在大鼠膝關節炎的建模中，將0.1 mL 4%碘乙酸鈉溶液50 μL注入大鼠膝關節腔，8周后處死大鼠，將膝關節軟骨組織活檢，發現大鼠Makin評分為(5.09±1.354)分，證實骨性關節炎造模成功。許世兵等[21]將碘乙酸鹽注入大鼠關節腔內，2周后通過組織病理檢查發現股骨下端脛骨平臺不整，關節軟骨缺失，軟骨細胞丟失，股骨和脛骨端骨質疏松，骨小梁面積顯著減少，證實成功建立大鼠KOA模型。

1.3.3瘦素 由肥胖基因編碼的瘦素實質上是一種由脂肪細胞分泌的多肽類激素，早期研究認為瘦素是脂肪細胞分泌的一種小分子激素,在中樞水平有著飽感因子的作用，主要調節食物攝入的增減，促進體內能量的消耗[22]。研究發現,瘦素在機體內可發揮多種生理作用,并與OA病情有關[23]。在炎癥反應中，瘦素能夠活化單核/巨噬細胞，增加炎性因子如腫瘤壞死因子α、白細胞介素6分泌，并促進T細胞向Th1細胞轉化，表達γ干擾素、白細胞介素2[24]。Hick等[25]將瘦素注入SD小鼠關節兩周后，取出關節軟骨活檢，證實關節炎小鼠局部注射瘦素后，不僅能夠誘導骨性關節炎提前發作，還能加重關節炎癥。

1.4外科手術介入

1.4.1破壞關節穩定性 關節穩定性是指人體關節在靜止或運動中維持正常位置的能力，膝關節是人體最復雜的關節，關節囊薄而松弛，穩定性主要靠髕韌帶、交叉韌帶、雙側副韌帶、斜韌帶以及雙側半月板維持，生理結構任何一環節的損傷都會影響膝關節穩定性，所以在動物建模中，可通過破壞關節的穩定性誘導關節腔內受力失衡，增加關節面的摩擦，加快實驗動物骨性關節炎發展的進程。

1.4.1.1Hulth法 Hulth法是骨性關節炎動物建模的經典方法之一[26]，研究人員將一側膝關節前、后十字交叉韌帶及同側副韌帶離斷，并破壞部分內側半月板，使得關節失穩，關節面之間的摩擦增大，半月板結構的失衡也使得關節腔內緩沖作用減小易導致KOA。肖春茍等[27]切斷內側副韌帶，去除內側半月板，術后1周便強迫運動，4周后取活組織病理檢查，發現關節面粗糙，關節軟骨退化，可見明顯骨性增生，成功建立兔KOA模型。Zhou等[26]在利用Hulth法后，取活組織蘇木精-伊紅染色后可見軟骨變薄，表面不光滑，軟骨細胞排列紊亂，出現多個空隙，軟骨表面退行性變，符合膝關節炎性變表現。

1.4.1.2交叉韌帶離斷術 交叉韌帶是防止脛骨移位、維持膝關節穩定性的重要結構之一，與膝關節屈曲伸直位、肌肉收縮狀態、負重或非負重區都有關系。交叉韌帶離斷術可分為單純前十字交叉韌帶離斷術和單純后十字交叉韌帶離斷術[28]。單純前十字交叉韌帶離斷術可以改變關節前向穩定，增大關節間活動度，增加骨摩擦，加快關節退行性變進程。Elmorsy等[29]對兔行單純前十字交叉韌帶離斷術術后，并將健側肢體固定于腹部，增加實驗側肢體負重，術后3 d強制運動，4周后出現關節積液，病理檢查發現滑膜增生，證實兔膝關節退行性變。單純后十字交叉韌帶離斷術改變了膝關節后向穩定性，對關節的作用機制同單純前十字交叉韌帶離斷術。陳剛等[30]對兔行單純后十字交叉韌帶離斷術后，術后3個月可見活組織病理檢查見軟骨不平整，軟骨細胞損傷，證實關節退行性變。

1.4.1.3單純半月板切除術 膝關節半月板有增加脛骨髁凹陷及襯墊股骨內外髁的作用，以增加關節的穩定性，緩沖關節腔震蕩，半月板的缺失可增加關節間的磨損，加快關節軟骨退行性變。劉俊才等[31]通過關節鏡切除小型豬雙膝外側半月板，術后12周即可觀察到關節出現局限性關節表面纖維化，股骨髁間隙出現骨質增生，組織學結果顯示，軟骨細胞數量和蛋白多糖數量減少，軟骨細胞成簇排列，KOA形成。Steinbrück等[32]采用切除單側大鼠內側半月板的方法，并將健側肢體固定于腹部，增加實驗側負重，術后4、6、10周大體觀察和術肢標準病理改變均符合典型KOA特征。

1.4.2關節劃痕法 通過關節劃痕可造成關節軟骨缺損，在關節自我修復的過程中，可觀察KOA的發展過程及修復進程，建立早期模型。但此種方法容易并發滑膜炎癥，會影響對關節軟骨炎癥的發生、修復的觀察。Vos等[33]在犬的膝關節股骨髁負重區造成劃痕，同時避免損傷軟骨周圍軟組織，10周后觀察發現軟骨損傷，軟骨細胞聚集，軟骨中金屬蛋白酶缺失，關節內膠原損害，蛋白多糖改變符合KOA表現。Marijnissen等[34]表示，該方法與單純前十字交叉韌帶離斷術所得出的動物模型表現相似，但是關節軟骨對關節劃痕法的敏感性遠低于單純前十字交叉韌帶離斷術，有利于建立骨關節炎早期表現。李釗等[35]用小針刀在兔子股骨髁軟骨面上進行刻痕，由于采用閉合刻痕法，切口較小，術后第2天開始強制運動，5周后取出造模側關節軟骨，有典型的骨關節病理改變。

1.4.3破壞關節血液循環 膝關節血液循環障礙可誘發關節周圍軟骨缺血性損傷，是臨床上常見的導致KOA的原因之一。Cheng等[36]對兔子行手術分離并結扎單側股靜脈，造成股骨干骺端及髓內血液供應阻斷，股骨內高壓，術后2 d強迫運動，10周后發現軟骨表面粗糙，表層出現裂隙，軟骨細胞退變，呈巢狀增生，表明早期內獲得動物骨性關節炎模型。戴七一等[37]采用手術切斷兔單側臀下靜脈、股靜脈、大隱靜脈的方式，造成股骨內高壓，8周后及獲得兔KOA模型。

1.4.4卵巢切除術 研究發現，切除SD雌性大鼠行卵巢后，成骨細胞及破骨細胞活性升高，但其中，成骨細胞升高只是短暫性的，而破骨細胞則呈持續性升高，持續的時間甚至可以達到術后數周，導致SD大鼠體內破骨細胞在很長時間內保持一個相對較高的水平，破骨細胞活性高于成骨細胞，致使骨吸收增多，導致SD大鼠骨質疏松，誘發骨性關節炎[38]。Kim等[39]將鼠卵巢切除后，發現代表骨吸收的Ⅰ型膠原C端肽及代表軟骨變化的Ⅱ型膠原C端肽明顯升高，且隨著時間的推移，兩者激素的水平與關節退行性變呈相關性，4周后可見大鼠股骨表面呈淡黃色，粗糙不平，膠原纖維變性，失去彈性，關節邊緣有骨質增生。王文勝等[40]采用大鼠卵巢切除聯合上下臺跑步的方法建立動物KOA模型，對SD大鼠行卵巢切除術后2 d開始強制上下坡跑步運動，4周后即可觀察到大鼠膝關節退行性變。

2 自發型動物模型

除人類以外，許多動物也會自發形成骨性關節炎，且形成機制與人類相似。與誘發型動物模型相比，自發型動物模型在自然條件下形成，未經人為干預，干擾因素少，因此實驗操作更為簡便，動物管理相對容易，避免了操作誤差，取得的KOA模型更接近臨床病理表現[41]。目前，自發性動物模型在許多動物實驗建模中普及，常用的動物有Hartly豚鼠、C57黑鼠等。Hartly豚鼠軟骨降解主要在負重區，與人類骨關節炎發生進程相似，Scott等[42]研究12個月齡雄性Hartly豚鼠膝關節，發現普遍關節軟骨不平整，軟骨細胞減少，膠原排列紊亂，糖胺聚糖異常分布，可做KOA模型。Pang等[43]在對C57黑鼠的自然飼養過程中，同樣發現10月齡的C57黑鼠可以天然自發形成骨性關節炎。自然條件形成的骨性關節炎動物模型形成過程緩慢，標本制作的時間長，所需費用高，這也成為制約自發型動物模型發展的瓶頸。

3 轉基因動物模型

據統計，人類38%～65%的KOA發病患者有一定的遺傳背景[44]。而隨著基因工程基準基因技術的發展，現代科學可以人為制造動物骨性關節炎遺傳基因，其遺傳機制甚至與人類相似。小鼠因其重復性好，樣本易于獲得且造模周期短，常被作為KOA基因型動物模型，目前多個小鼠標記基因已用于骨關節炎的基因轉染、基因敲除。丁道芳等[45]就成功激活調控軟骨細胞凋亡的相關基因，促使軟骨細胞過度凋零，以此模仿長時間勞損造成的骨關節炎病理過程。于斐等[46]嘗試敲除15月齡小鼠沉默信息調節因子1,并向腹腔注射Tamoxifen，導致膠原本能合成正常的膠原纖維，致使小鼠出現KOA表現。轉基因動物模型可減少手術、關節腔注射及關節制動等造成的操作誤差，在研究骨關節炎的起始機制、關節軟骨生化的改變等方面有明顯的優勢，很好地排除了感染、創傷對骨關節炎動物模型軟骨、滑膜的影響，同時也減輕了建模過程中給動物帶來的痛苦。

4 展 望

KOA病因復雜，與多種因素有關。在研究過程中，不同的動物物種表現的病理發展過程不盡相同，各種模型都有其優缺點。在選擇動物模型時，應全面考慮其生活習性、關節特征、關節力學特征。一個理想的KOA動物模型可以幫助進一步了解KOA病因病理，尋找更有效的治療方式，建立統一、客觀的療效評估。然而到目前為止，還并未建成一個理想的骨性關節炎動物模型。相信隨著KOA建模方法的不斷完善，在預防、治療KOA方面會取得突破性進展。