超聲微泡在心血管疾病診治中的應用進展

鄭曉東，李 珊，劉映峰，繆 緋

(南方醫科大學珠江醫院心血管內科，廣州510280)

近年來，全球心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)的發病率及死亡率逐年上升，盡管各種預防措施、診斷方法和治療手段均取得了實質性進展，但CVD在北美仍是發病率和死亡率最高的疾病之一[1]。近年來我國CVD的發病率也逐年升高[2]。因此學者們期待有更多的方法和技術對當前CVD的診治進行補充，其中包括超聲微泡技術。

超聲微泡技術是一種無創、具有組織特異性的新技術，其以超聲微泡作為媒介，在超聲下實時顯影靶器官。超聲微泡的微泡是由外殼包裹惰性氣體構成，常見的外殼包括蛋白質、脂類以及高分子聚合物，大小為1～8 μm[3]。微泡經外周靜脈到達特定器官后，在超聲輻照下呈非線性的反射信號，具有比普通超聲更佳的分辨率和對比度，尤其是對于肺氣腫、肋間隙狹窄、肥胖等聲學顯影不佳的疾病，超聲微泡的顯影優勢更為明顯。第3代超聲微泡具有不易透過組織間隙、無肝腎毒性、在血液中穩定存在等優勢，具有良好的生物安全性和臨床應用價值[4]。對微泡表面進行特定抗原或配體修飾后制備成靶向微泡，在靶向超聲成像技術支持下，可以在細胞水平和分子水平分析活體組織的生物過程，能夠對疾病發生發展中的重要分子和轉導途徑間接成像，為早期診斷和治療疾病提供新的方法[5-6]?，F就超聲微泡在CVD診斷和治療中的應用現狀進行綜述。

1 超聲微泡在高血壓腎損傷診治中的應用

長期高血壓是導致腎動脈粥樣硬化的主要原因，腎動脈粥樣硬化可發展為高血壓性腎損傷。血清尿素氮、血肌酐只有在腎小球濾過率下降1/3～2/3時才明顯升高，而尿蛋白陽性能反映早期高血壓腎功能損傷，但上述方法均無法評估單個腎臟的功能，而且對診斷高血壓腎損傷存在一定的滯后性，而超聲微泡檢查可以克服這些局限性[7]。楊榮和李明星[8]發現，在評估窒息新生兒早期腎功能損傷中，超聲微泡測得的腎血流動力學參數的敏感性及有效性均優于尿素氮和血肌酐，并能評估單個腎臟的灌注情況。在動物實驗方面，朱向明等[9]的研究表明，超聲微泡可對自發性高血壓大鼠的早期腎功能損傷進行定量評估。Le Dorze等[7]發現，超聲微泡可較實驗室指標更早發現早期高血壓腎功能損傷的腎實質灌注異常和腎動脈硬化程度。在治療方面，對已經發生高血壓腎損傷的患者，超聲微泡可以評估腎功能損傷的程度，定期隨訪可動態監測疾病進展，為臨床治療提供參考[10-11]。目前已有報道將攜帶基因的靶向微泡，通過微泡破壞技術將基因定向釋放于靶組織，從而在基因水平治療及預防腎功能不全[12]。超聲微泡技術可實現在分子和基因水平治療高血壓腎功能不全。

2 超聲微泡在心力衰竭診治中的應用

普通超聲對于評估存在肺氣腫、肥胖、肋間隙狹窄、胸腔或心包內置管的患者的心功能有一定的局限性[13]，超聲微泡檢查一定程度上可以優化此類患者的心功能評估。Tomaszuk-Kazberuk等[14]對30例冠狀動脈旁路移植術后進行普通超聲和超聲微泡檢查的患者進行比較，結果發現，在心臟510個節段中，普通超聲有217個節段顯影不清，而超聲微泡檢查僅有4個節段顯影不佳，因此超聲微泡檢查能清晰顯示更多心臟節段。Larsson等[15]采用普通超聲和超聲微泡檢查患者左心室射血分數和左心室容積發現，在普通超聲檢查中，不同超聲醫師之間得出的結果存在顯著差異，而采用超聲微泡檢查這種差異性明顯降低，提示超聲微泡檢查可以減少超聲醫師主觀偏倚造成的結果差異。皮淑芳等[16]報道了1例因肥胖導致透聲條件差的心力衰竭患者，超聲微泡檢查顯示心肌致密化不全，左心室側壁及心尖部肌小梁粗大，深陷隱窩內可見微泡填充，致密層和非致密層分界清楚。相對于普通超聲，超聲微泡檢查在心功能診斷中具有更高的敏感性和準確性[17]。

在心力衰竭治療方面，動物實驗發現，一定強度的超聲輻照或可對心肌產生正性肌力作用[17-19]。Forester等[20]研究不同強度的超聲對離體大鼠乳頭肌收縮功能的影響發現，0.25～2.0 W/cm2的超聲強度可明顯增強大鼠乳頭肌的收縮。Hanawa等[19]對豬左心室射血分數減低的慢性心肌缺血模型進行研究發現，低強度超聲(193 mW/cm2)輻照治療8周后，治療組左心室射血分數較對照組明顯升高(P<0.05)，但過強的超聲強度可導致不良的生物學效應，甚至導致細胞死亡。如果能確定有效且安全的超聲強度以誘導心肌正性肌力效應，將是心力衰竭無創治療的重要突破[17]。

3 超聲微泡在急性冠狀動脈綜合征診治中的應用

3.1超聲微泡對急性心肌缺血的評估 目前臨床上評估急性心肌缺血的方法包括心電圖、心肌損傷標志物的動態演變、心臟放射性核素檢查、心臟磁共振、冠狀動脈造影檢查、超聲微泡等，其中超聲微泡具有床旁檢查及時性和實時性等優點。在缺血炎癥反應中，P選擇素可在幾分鐘內迅速表達并可持續數小時，隨后細胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)也大量表達，因此P選擇素和ICAM-1是評價早期心肌缺血的理想指標[21-22]。有學者成功構建了攜帶P選擇素的靶向超聲微泡，并成功用于評估小鼠心肌缺血再灌注后的炎癥反應，可間接判斷心肌缺血的范圍[23]。紀麗景等[22]利用P選擇素單抗靶向微泡評估小鼠心肌缺血再灌注損傷，結果顯示，靶向微泡在缺血心肌中的黏附率較小靜脈提高了10倍，缺血心肌中靶向微泡的顯影效果較普通微泡提高了4倍。有研究表明，裝載ICAM-1的靶向微泡對缺血的炎癥組織有較高的檢出率，可用于缺血再灌注心肌的診斷[24-26]。對超聲微泡進行特異性抗體或配體的修飾，可以提高缺血心肌的檢出率，如果能在微泡中包裹治療的藥物或基因，使其在微泡靶向結合的基礎上定向釋放藥物，或可實現缺血心肌的精準治療[25]。

在評估冠狀動脈血流方面，超聲微泡可以精確測量微循環血流，具有無放射性、無創、相對簡便等優點。Gaibazz等[27]評估了400例超聲負荷試驗患者的冠狀動脈情況發現，狹窄程度>50%的患者中，超聲微泡造影具有較高的靈敏度(96%)和準確度(86%)。Senior等[28]比較了516例冠心病患者的超聲微泡檢查和單光子發射斷層掃描顯示，超聲微泡檢查具有更高的敏感性。超聲微泡檢查用于急診胸痛的鑒別診斷時，或可減少不必要的住院和侵入性心臟檢查[29]。20世紀90年代已有學者發現，低頻高強度超聲有擴張冠狀動脈的作用[30]。在此基礎上，Miyamoto等[31]使用低頻高強度超聲(27 kHz，1.4 W/cm2)經胸輻照犬的冠狀動脈，5 min后行冠狀動脈造影及血管內超檢查發現，冠狀動脈管徑較前擴大，并與冠狀動脈內灌注硝酸甘油的效果相當。超聲輻照結束1 h后檢查發現，冠狀動脈管徑恢復，這表明超聲的擴張冠狀動脈的作用是可逆的[31]。這或可成為一種潛在的治療急性冠狀動脈綜合征的方法，在血運重建前擴張冠狀動脈并改善心肌缺血。

3.2超聲微泡在冠狀動脈血栓診治中的應用 血栓形成是急性冠狀動脈綜合征的常見原因，靶向超聲微泡可以實現無創血栓顯影。在超聲微泡表面組裝血栓形成過程中關鍵分子的抗體或配體，使微泡與血栓靶向結合可實現超聲下血栓顯影。國外有學者構建了攜帶有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的超聲微泡，其能與血栓中的ⅡbⅢa受體特異性結合，在體內外均能增強血栓顯影，在診斷急性冠狀動脈綜合征血栓病變中具有重要價值[32-33]。在靶向微泡特異性結合血栓的基礎上，一定強度的超聲輻照產生的空化效應可使血栓軟化甚至溶解[34]。也有學者在靶向微泡中包裹溶栓藥物，定向爆破微泡釋放藥物可增加溶栓效果，提升心肌灌注、改善心功能[30,35]。Xie等[36]用豬冠狀動脈血栓栓塞模型進行超聲溶栓實驗，結果顯示，在心外膜血管未恢復時，超聲微泡溶栓仍可有效增加心肌供血，明顯減少心肌梗死面積。提示超聲微泡溶栓可促進微循環開放，為解決急性冠狀動脈綜合征治療過程中的無復流及慢血流提供新思路。

4 超聲微泡在心肌干細胞移植中的應用

梗死心肌不能再生是目前心肌梗死后治療的一大難題。干細胞移植治療心肌梗死的前景日益廣闊，目前認為骨髓間充質干細胞是心肌梗死再生治療的理想細胞，但由于心肌梗死后的缺血損傷、再灌注損傷、炎性因子過度表達、氧化應激、神經內分泌激活等導致心肌梗死后干細胞移植存活及分化率較低，不能滿足臨床需求。超聲微泡技術的出現有望提高心肌干細胞移植的成功率[37]。國內研究證實，超聲微泡處理能促進干細胞向心肌缺血區域歸巢，促進毛細血管生成，改善心肌梗死后的心功能[38]。Song等[39]報道，經超聲微泡破壞技術處理大鼠梗死心肌后，電鏡下可見血管內皮細胞間隙增寬、微血管破裂，提示微泡破壞技術可優化移植微環境，進一步研究發現，超聲微泡技術處理后分化細胞明顯增多，內皮細胞和平滑肌細胞形成的新生毛細血管的密度明顯增加，提示微泡破壞技術可提高移植后細胞的成活率和分化率[39]。Ling等[37]以犬為研究對象，利用不同參數靶向微泡破壞預處理梗死心肌，經冠狀動脈注射間充質干細胞，結果顯示，該方法增強了干細胞治療心肌梗死的效果，有效改善了心功能，同時得出了一組相對較佳的超聲輻照參數：頻率為1 Hz，脈沖超聲強度為1 W/cm2。但超過一定強度的超聲輻照可促使心肌細胞凋亡，因此尋找合適強度的超聲微泡改善移植微環境，或可提高心肌梗死干細胞移植治療的成功率。

5 超聲微泡介導基因轉染的應用

基因治療是將外源性基因導入靶細胞，糾正或補償基因缺陷引起的疾病，從而達到治療目的。基因治療能從分子水平調整細胞功能，使其成為預防和治療CVD的一個具有前景的有力措施。超聲靶向微泡破壞是指利用超聲和攜帶靶基因的微泡實現基因轉染，是目前基因轉染研究的熱點。靶向微泡的聲孔效應和空化效應能夠提高細胞膜的通透性，從而提高基因轉染的有效率。與傳統病毒載體相比，靶向超聲微泡能夠增加基因轉染的特異性和成功率，且具有低免疫原性、低費用以及低系統毒性等特點。Fujii等[40]研究了超聲微泡介導的基因轉染在大鼠心肌梗死模型中的治療效果，結果提示，重復使用超聲微泡介導基因轉染能有效增加新生血管數量，減少心肌梗死面積，改善左心室功能。證實質粒DNA能通過反復超聲微泡介導延長基因壽命。蘇強[41]的研究表明，超聲微泡靶向轉染技術能夠成功轉染微RNA-21至心肌細胞中，實現轉染基因的有效表達，并通過抑制程序性細胞死亡因子4/核因子κB/腫瘤壞死因子α信號轉導通路，減少心肌炎癥反應以改善心臟功能。Liu等[42]已成功構建了靶向超聲微泡破壞的微RNA-21質粒，并在豬冠狀動脈微栓塞模型中證實，該質粒轉染基因后能顯著降低凋亡相關蛋白4抗體的表達與核因子κB的活性，提高了心臟功能。超聲微泡破壞技術介導基因轉染是治療CVD的一種無創、安全、高效的方法[40]。

6 展望和不足

隨著對超聲微泡技術研究的深入，其在CVD診治中的優勢也顯示出來，靶向微泡技術診斷疾病的敏感性和特異性均更高，體現了精準醫療的理念[12]。超聲微泡技術除在高血壓腎損傷、心力衰竭、急性冠狀動脈綜合征等疾病的診治中有實質性進展外，在其他CVD中也有可觀的發展前景。Hanawa等[19]的研究表明，超聲微泡輻照可有效抑制血管內皮增生，誘導平滑肌細胞凋亡，并可無創、有效地改善介入術后支架內的再狹窄。Hersch和Adam[43]發現，結合正壓和負壓脈沖超聲輻照大鼠心臟，記錄到室性早搏的發生率為70%，提示超聲輻照有潛能成為體外起搏和除顫的新方法。

目前超聲微泡技術診治CVD大多處于基礎研究階段，仍存在許多亟待解決的問題：①目前大部分疾病的靶向分子尚未明確，需要研究制備更加特異性的靶向超聲微泡，以降低對非目標器官的影響；②盡管在動物研究中靶向超聲微泡獲得了一些積極成果，但微泡與細胞的作用機制、具體治療方案等仍需解決；③目前微泡制備技術仍需改善，超聲微泡在體內的穩定性，特別是修飾后裝載藥物或基因的穩定性仍需進一步提高；④過強的超聲輻照會引起心肌微血管滲漏、破裂，甚至炎性細胞浸潤，心肌細胞損傷等不良反應；不合適的超聲輻照又無法誘發微泡破壞釋放藥物，降低基因轉染率等。因此尋找安全有效的超聲閾值迫在眉睫?？傊S著超聲微泡技術的日益發展，相信能研制出穩定性更好、靶向性更強、治療效果更佳的超聲微泡以滿足臨床需要，為CVD的診療帶來更多希望。