小麥脫水素wzy1-2基因的遺傳轉化及干旱脅迫下不同生育期表達水平

田 野，于正陽，史學英，齊玉紅，張大鵬，張林生

(西北農林科技大學生命科學學院，旱區作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西 楊凌 712100)

干旱是限制農業生產的一個重要環境因素，我國干旱、半干旱地區面積約占全國土地面積的50%，主要分布于西北地區。小麥是主要糧食作物之一，干旱造成10%～20%的作物減產。研究小麥的抗旱機理對糧食增產具有重要意義[1]。目前人們在小麥抗逆研究領域做了大量工作，但由于小麥基因組非常龐大，對于逆境脅迫響應的分子生理機制仍然不清。揭示小麥耐逆境脅迫的分子機制和改良小麥抗逆性已經成為當前農業研究的主要目標之一[2]。

研究表明，胚胎發育晚期豐富蛋白(LEA)是植物在非生物脅迫過程中防御逆境的重要功能蛋白之一，在減少環境脅迫對自身傷害中起到重要作用[3]。脫水素是胚胎發育晚期豐富蛋白第二家族蛋白，通常以無規則卷曲形態存在，這種形態是高度水合狀態，當細胞失水時，其構象會發生變化，從而行使多種功能[4]。脫水素屬于熱穩定的水溶性蛋白，它受寒冷、高溫、干旱以及鹽脅迫等逆境誘導，對保護生物代謝可能起到分子伴侶的作用，對細胞膜結構的穩定性起保護作用，從而減輕干旱對植物造成的傷害。近年來研究逆境脅迫(低溫、干旱和高鹽等)下，部分脫水素的表達還受到脫落酸(ABA)的誘導作為功能蛋白大量表達[5]。脫水素一般包含有Y((V/T)D(E/Q)YGNP)、S(5～7個Ser殘基)和K(EKKGIMDKIKEKLPG)3個保守的氨基酸片段，而K片段是脫水素所共有的。按照脫水素Y、S、K保守區片段的組合及排列順序，將其分為5個亞類：YnSKn、YnKn、SKn、KnS和Kn[6]。

為研究wzy1-2基因的抗旱功能及建立完整的轉基因體系，本試驗通過基因槍介導法[7]，將wzy1-2干擾載體轉入鄭引1號小麥中，獲得穩定遺傳的轉基因植株。通過研究干旱脅迫處理下小麥WZY1-2蛋白的表達量，分析該基因在小麥不同生育期的表達規律，探索脫水素wzy1-2基因在植物抗旱方面的功能，為篩選抗旱小麥品種提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試小麥品種鄭引1號和陜合6號由西北農林科技大學生命科學學院提供。

大腸桿菌JM109、干擾表達載體pTCK303由西北農林科技大學生命科學學院保存；pMD18-T載體和DNA Marker均購自Takara公司；凝膠回收試劑盒及小量質粒提取試劑盒均購自天根生化技術(北京)有限公司；RNA提取試劑Trizol購自Invitrogen公司；序列測定由華大基因(深圳)科技有限公司完成。

1.2 構建載體及鑒定

取10 μg使用Trizol試劑提取的葉片總RNA進行反轉錄[8]，并將擴增的cDNA片段克隆到pMD18-T載體。將連接產物轉化至大腸桿菌E.coli，篩選具有氨芐抗性的克隆，提取質粒DNA，酶切鑒定重組質粒并測序。將pMD18-T-正向片段和pMD18-T-反向片段，分別通過SacⅠ/ SpeⅠ和BamHⅠ/KpnⅠ限制性內切酶連接到RNAi表達載體pTCK303中，轉化Top10感受態細胞。菌落PCR鑒定挑選陽性克隆，提質粒后分別用SacⅠ/ SpeⅠ和BamHⅠ/ KpnⅠ限制性內切酶對重組質粒進行酶切驗證[9]。

1.3 基因槍轉化

1.3.1 供體材料 選用小麥品種為“鄭引1號”，在西北農林科技大學小麥試驗田種植，正常管理。收集生長70～90 d的小麥麥穗，從穗中剝出穎果，用70%乙醇將小麥穎果滅菌。無菌環境顯微鏡下分離幼胚并且切除胚軸，將10～20個盾片放置在包含誘導培養基的培養皿，放在22℃黑暗條件下預培養1～2 d[10]。

1.3.2 基因槍轉化 參考蘇君藝等[11]的方法對小麥進行愈傷組織誘導和轉化。轉化后的愈傷組織轉入恢復培養基培養2～3 d，再于分化培養基中培養28～35 d。將分化出的幼苗轉入生根壯苗培養基中，在幼苗根長2～3 cm時轉入4℃培養箱春化28 d，后移栽入花盆中培養。

1.4 轉基因T0代植株PCR鑒定及qRT-PCR鑒定

待幼苗長到三葉一心期，利用CTAB法提取小麥基因組DNA。利用潮霉素抗性基因(491bp)設計引物并合成[12]。PCR鑒定體系和程序參考2×TaqMaster Mix(Takara)說明書進行，退火溫度為57℃，循環數為35 cycle，擴增產物通過2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測。將鑒定為陽性的植株移至13 cm2大小盒中培養。利用wzy1-2 基因序列設計特異性定量引物并合成，利用Trizol(Takara)提取小麥總RNA以小麥β-Actin基因為內參[13]，使用CFX 96 Touch Real-time PCR Detection System (Bio-Rad)，按照SYBRPremix Ex TaqTM試劑盒 (Takara) 說明書進行qRT-PCR。

1.5 干旱脅迫處理及WZY1-2蛋白的表達分析

1.5.1 小麥干旱脅迫處理 用直徑30 cm、高20 cm的塑料花盆種植小麥，土壤持水量約為21.98%，每盆裝土8 kg，將陜合6號和鄭引1號小麥品種分別種植30盆，正常生長的盆栽試驗小麥的土壤含水量保持在田間持水量的70%～75%。培養地點為西北農林科技大學組織培養室內，用稱重法控水。2個不同品種的小麥生長到苗期、分蘗期、拔節期和開花期，用稱重法控水進行干旱處理[14]。試驗設為3個處理，正常組土壤含水量為田間持水量(θ田)的75%，中度干旱脅迫含水量為50%θ田，重度干旱脅迫含水量為35%θ田，對各處理小麥葉片進行采樣[15]，樣品-80℃保存備用。分別在4個生長時期進行干旱處理，生長其余過程均進行正常灌溉，直至小麥成熟。

1.5.2 葉片可溶性蛋白提取及測定 參照植物蛋白提取試劑盒說明書提取可溶性葉片蛋白[16]，參照Bradford蛋白定量試劑盒的說明書測定小麥可溶性蛋白含量。將提取定量后的蛋白稀釋一定比例后與蛋白上樣緩沖液混勻，煮沸變性10 min，進行SDS-PAGE電泳和Western blot 檢測。

2 結果與分析

2.1 目的基因wzy1-2的獲得

采用Trizol法提取的鄭引1號小麥總RNA純度較高，無明顯降解，可滿足反轉錄的要求。以反轉錄cDNA為模板，用兩端含有合適酶切位點的引物進行PCR擴增后，回收擴增產物，將回收產物與克隆載體pMD-18T連接，轉化。對陽性克隆進行檢測后，得到大小為789bp的條帶，與預期大小相符。測序結果表明目的基因克隆正確(圖1)。

2.2 質粒轉化大腸桿菌

當質粒轉化大腸桿菌后，進行菌落PCR檢測和酶切鑒定，挑取單克隆培養后，進行菌落PCR檢測(圖2)。對于陽性菌液進行了酶切檢測，圖3為酶切檢測結果，證明挑取的單克隆是陽性菌株，質粒成功地轉入到大腸桿菌中。

注：M：Marker；1～6泳道：脫水素基因wzy1-2產物。Note: M: Marker; 1～6 lane: Product of dehydrin gene wzy1-2.圖1 脫水素基因wzy1-2序列擴增Fig.1 Amplification of dehydration gene wzy1-2 sequence

2.3 基因槍介導幼胚轉化過程

圖4展示了轉基因小麥幼胚的各個生長階段。遺傳轉化的轉化率比較低，最終僅得到9株再生植株(表1)。

2.4 抗性植株的PCR檢測結果

對來源于鄭引1號的再生植株進行PCR檢測，以初步確定其中的轉基因陽性株系。對這9株植株進行了Hpt基因的PCR檢測，圖5是再生植株中標記基因Hpt的PCR檢測結果，目標條帶長度504 bp。綜上可以初步確定，共獲得6株陽性植株。

2.5 T0代轉基因小麥中wzy1-2基因表達量的檢測

利用定量PCR對T0代RNAi轉基因小麥植株的wzy1-2基因表達量進行分析(圖6)，與野生型鄭引1號相比，檢測的6株T0代轉基因小麥植株表達量均有不同程度下降，其中前2個株系的表達量下降達40%～70%，株系6下降80%左右，而株系7～9下降70%～80%，選擇株系5～9作為后續試驗研究的材料。

注：M：Marker；1～3泳道:正向片段陽性克?。?～6泳道:反向片段陽性克隆。Note: M: Marker; 1～3 lane: Positive fragment positive clones; 4～6 lane: Reverse fragment positive clones.圖2 重組質粒的菌落PCR驗證Fig.2 Colony PCR validation of recombinant plasmids

注：M: Marker；1,3泳道：正向片段重組載體酶切鑒定檢測結果；2,4泳道：反向片段重組載體酶切鑒定檢測結果。Note: M: Marker; 1, 3 lane: Identification of the positive segment recombinant vector by enzyme digestion; 2, 4 lane: Reverse strand recombinant vector identification by enzyme digestion.圖3 重組pTCK303載體酶切鑒定Fig.3 Identification of recombinant pTCK303 vector digested

2.6 干旱脅迫下不同發育時期小麥脫水素WZY1-2表達量分析

通過對陜合6號和鄭引1號小麥4個不同生長時期進行不同程度的干旱脅迫處理，可溶性蛋白SDS-PAGE分析結果如圖7～圖10所示，陜合6號和鄭引1號2種小麥苗期分子量在25kDa～70kDa的蛋白條帶比較多，而且條帶顏色比較深；分蘗期也是25kDa～70kDa的蛋白條帶較多，但是顏色較苗期淡；拔節期的蛋白條帶在30kDa～70kDa的蛋白條帶較多，條帶數較苗期和分蘗期少，集中在40kDa～70kDa，顏色較分蘗期淡；開花期和拔節期2種小麥的蛋白條帶相似，拔節期蛋白條帶顏色較淡。隨著干旱程度的增加，小麥蛋白條帶數量減少。陜合6號和鄭引1號小麥可溶性蛋白的SDS-PAGE分析結果相似。

注：A.誘導培養基上的幼胚愈傷組織；B.分化篩選培養基上的愈傷組織；C.生根培養的再生苗；D.在營養土上生長的再生苗移栽成株。Note: A. Callus of immature embryos on induction medium; B. Callus on differentiation screening medium; C. Regeneration seedlings grown in rooting; D. Transplantation of regenerated seedlings grown on nutrient soil strain.圖4 轉基因小麥的獲得Fig.4 Obtaining of transgenic wheat

表1 基因槍轉化小麥幼胚統計

注：M：Marker；1：重組載體；3：空白對照；4：野生型植株；2,5～9：為不同的T0代RNAi轉基因植株。Note: M: Marker; 1: Recombinant vector; 3: Blank control; 4: Wild type plants; 2, 5～9: Different T0 generation RNAi transgenic plants.圖5 轉基因小麥T0代植株Hpt基因PCR檢測結果Fig.5 PCR results of Hpt gene in T0 generation transgenic wheat plants

注：2,5～9為不同轉基因株系。 WT: 野生型小麥植株。Note: 2,5～9 are different transgenic lines. WT: Wild-type wheat plants.圖6 RT-PCR檢測T0代RNAi轉基因植株中wzy1-2 基因表達量Fig.6 RT-PCR detection of wzy1-2 gene expression in T0 generation RNAi transgenic plants

注：M：蛋白marker；設置CK為正常組，75%θ田；50%θ田為中度干旱脅迫；35%θ田為重度干旱脅迫。下同。1：鄭引1號，50%θ田；2：陜合6號，50%θ田；3：陜合6號，35%θ田；4：陜合6號,CK；5：鄭引1號，35%θ田；6：鄭引1號,CK。Note: M： Protein marker; CK is normal, 75%θ田；50% θ田 is moderate drought stress； 35% θ田 is severe drought stress. The same below. 1：50% θ田 of Zhengyin 1；2: 50% θ田 of Shaanhe 6; 3： 35% θ田 of Shaanhe 6; 4： CK of Shaanhe 6; 5： 35% θ田 of Zhengyin 1; 6： CK of Zhengyin 1.圖7 2種小麥苗期可溶性蛋白在不同程度干旱處理下SDS-PAGE(A)和WZY1-2蛋白Western blot分析(B)Fig.7 SDS-PAGE (A) of soluble protein in seedling stage of two wheat varieties under different drought-stresses and Western blot analysis (B)

注：M：蛋白marker。1：陜合6號,CK；2：鄭引1號,CK；3：陜合6號，35%θ田；4：鄭引1號，35%θ田；5：陜合6號，50%θ田；6：鄭引1號，50%θ田。Note: M： Protein marker. 1: CK of Shaanhe 6; 2: CK of Zhengyin 1; 3： 35% θ田 of Shaanhe 6; 4： 35% θ田 of Zhengyin 1; 5： 50% θ田 of Shaanhe 6; 6： 50% θ田 of Zhengyin 1.圖8 2種小麥分蘗期可溶性蛋白在不同程度干旱處理下SDS-PAGE(A)和WZY1-2蛋白Western blot分析(B)Fig.8 SDS-PAGE (A) of soluble protein in tillering stage of two wheat varieties under different drought stresses and Western blot analysis (B)

注：M：蛋白marker。1：陜合6號，35%θ田；2：鄭引1號，50%θ田；3：陜合6號，50%θ田；4：陜合6號,CK；5：鄭引1號,CK；6：鄭引1號，35%θ田。Note: M: Protein marker. 1: 35% θ田 of Shaanhe 6; 2: 50% θ田 of Zhengyin 1; 3: 50% θ田 of Shaanhe 6; 4: CK of Shaanhe 6; 5: CK of Zhengyin 1; 6: 35% θ田 of Zhengyin 1.圖9 2種小麥拔節期可溶性蛋白在不同程度干旱處理下SDS-PAGE(A)和WZY1-2蛋白Western blot分析(B)Fig.9 SDS-PAGE (A) of soluble protein in jointing stage of two wheat varieties under different drought stresses and Western blot analysis (B)

注：M:蛋白marker。1：陜合6號，CK；2：陜合6號，50%θ田；3: 陜合6號，35%θ田；4:鄭引1號，CK；5:鄭引1號，50%θ田；6:鄭引1號，35%θ田。Note: M: Protein marker. 1: CK of Shaanhe 6; 2: 50%θ田 of Shaanhe 6; 3: 35%θ田 of Shaanhe 6; 4: CK of Zhengyin 1; 5: 50%θ田 of Zhengyin 1; 6: 35%θ田 of Zhengyin 1.圖10 2種小麥開花期可溶性蛋白在不同程度干旱處理下SDS-PAGE(A)和WZY1-2蛋白Western blot分析(B)Fig.10 SDS-PAGE (A) of soluble protein in flowering stage of two wheat varieties under different drought stresses and Western blot analysis (B)

為進一步研究小麥WZY1-2蛋白在不同生育期的抗旱性，通過Western blot分析，2種小麥4個不同生長時期干旱處理均在60kDa有一條特異性蛋白條帶，即小麥WZY1-2蛋白(圖7B,8B,9B,10B)。苗期陜合6號在干旱脅迫下雜交的非特異條帶多，且條帶顏色比較深，鄭引1號的雜交的非特異條帶很少，而小麥WZY1-2蛋白在60 kDa雜交的蛋白條帶深度相當。分蘗期的陜合6號和鄭引1號的雜交的非特異條帶相當，且隨著干旱脅迫的增加，非特異條帶減少，而陜合6號小麥WZY1-2蛋白在60kDa雜交的蛋白條帶顏色較鄭引1號深。拔節期陜合6號和鄭引1號的雜交的非特異條帶很少，2種小麥WZY1-2蛋白在60kDa雜交的蛋白條帶顏色相當。開花期2種小麥的非特異性條帶相當，并且較多，2種小麥WZY1-2蛋白在60kDa雜交的蛋白條帶顏色相當。苗期和拔節期、開花期2種小麥WZY1-2蛋白雜交的特異性條帶深度相當，而分蘗期鄭引1號WZY1-2蛋白雜交的特異性條帶較陜合6號淺。小麥WZY1-2蛋白在2種小麥的4個不同時期的表達結果趨勢一致，隨著干旱程度的增加，WZY1-2蛋白的條帶明顯比正常生長組的條帶顏色深，條帶粗，特別是重度脅迫時WZY1-2蛋白的條帶顏色最深。

通過Quantity One V 4.6.2(Bio-Rad)軟件對小麥陜合6號和鄭引1號Western blot分析，如圖11所示，分別將4個時期的正常生長組的蛋白表達量設為1，苗期中度干旱脅迫和重度脅迫的陜合6號WZY1-2蛋白表達量分別是正常組生長的1.3倍和2.9倍，鄭引1號WZY1-2蛋白表達量分別是正常組生長的1.4倍和2.8倍；分蘗期中度干旱脅迫和重度脅迫的陜合WZY1-2蛋白量表達量分別是正常組生長的1.1倍和1.8倍，鄭引1號WZY1-2蛋白量表達量分別是正常組生長的1.3倍和1.5倍；拔節期中度干旱脅迫和重度脅迫的陜合6號WZY1-2蛋白表達量分別是正常組生長的1.3倍和2倍，鄭引1號WZY1-2蛋白表達量分別是正常組生長的1.5倍和2.1倍；開花期中度干旱脅迫和重度脅迫的陜合6號WZY1-2蛋白量表達量分別是正常組生長的1.3倍和1.9倍，鄭引1號WZY1-2蛋白量表達量分別是正常組生長的2.4倍和2.5倍。小麥WZY1-2蛋白在陜合6號和鄭引1號小麥4個不同時期的表達趨勢一致，隨著干旱程度的增加，2種小麥WZY1-2蛋白表達量增加，特別是重度干旱脅迫下小麥WZY1-2蛋白的表達量達到了峰值。

注：1.苗期正常組；2.苗期中度干旱脅迫；3.苗期重度干旱脅迫；4.分蘗期正常組；5.分蘗期中度干旱脅迫；6.分蘗期重度干旱脅迫；7.拔節期正常組；8.拔節期中度干旱脅迫；9.拔節期重度干旱脅迫；10.開花期正常組；11.開花期中度干旱脅迫；12.開花期重度干旱脅迫。Note: 1: Normal seedling stage; 2: Moderate drought stress during seedling stage; 3: Severe drought stress during seedling stage; 4: Normal tillering stage; 5. Moderate drought stress during tillering stage; 6: Severe drought stress during tillering stage; 7: Normal jointing stage; 8:Moderate drought stress during jointing stage; 9: Severe drought stress during jointing stage; 10: Normal flowering stage; 11: Moderate drought stress during flowering stage; 12: Severe drought stress during flowering stage.圖11 光密度測定免疫印跡條帶強度Fig.11 Densitometric Western blot band intensity

3 結 論

通過小麥WZY1-2蛋白的表達量隨著干旱程度的增加而升高，苗期小麥WZY1-2蛋白的表達量均高于其它3個生長時期，表明小麥脫水素wzy1-2是干旱誘導型基因。

另外，本研究得到了脫水素WZY1-2在小麥苗期、分蘗期、拔節期和開花期干旱處理的表達規律。2個不同抗旱性小麥品種，陜合6號(干旱耐受型)和鄭引1號(干旱敏感型)在4個生長時期隨著干旱程度增加，WZY1-2蛋白的表達量升高，其機理有待進一步研究。

4 討 論

小麥遺傳轉化研究相比于其他植物而言起步雖晚，但發展較快。Vasil等[17]利用基因槍介導法將bar基因導入小麥品種“Pavon”，獲得了世界上第一例轉基因小麥植株，為展開小麥分子育種奠定了基礎[17]。許多研究者利用不同方法將多種基因導入了小麥，獲得了不同性狀的轉基因植株。Weeks等[18]利用基因槍介導法分別將β-葡萄糖苷酸標記基因(GUS)、bar基因導入了小麥，初步建立了基因槍法轉化小麥的技術體系[18]。隨后基因槍法在單子葉植物方面的轉化技術越來越成熟，很多學者通過基因槍法獲得了不同抗性的轉基因小麥[19]。雖然農桿菌介導法具有操作簡單、成本低廉等優點，但小麥并不是農桿菌的天然宿主，轉化效率低，小麥外植體受到的傷害較大，進而對轉基因的效率產生影響[20]。

目前常用的農桿菌介導法和基因槍法分別占到小麥遺傳轉化的15.9%和68.8%[21]。本試驗通過基因槍法成功獲得wzy1-2基因的遺傳轉化植株，但轉化效率低的問題仍然存在，這與受體處理方式及時間、受體培養及篩選、外植體的基因型和轉化條件等相關[22]，過低的轉化率一直是限制基因槍法廣泛應用的關鍵因素之一[23]。

脫水素屬于LEA2家族,是目前研究較為深入的一類LEA蛋白。其二級結構含有大量極性氨基酸,其中賴氨酸和甘氨酸含量最高；具有較強的親水性和熱穩定性，缺乏非極性疏水氨基酸 (半胱氨酸、色氨酸)[24]。在逆境脅迫下，部分脫水素的表達還受到脫落酸(ABA)誘導作為功能蛋白大量表達[5]。本試驗成功構建含反向重復序列的RNA干擾表達載體，通過基因槍轉化獲得再生植株26株，再生率為1.03%。利用表達載體上Hpt基因的特異引物，檢測到6株Hpt基因陽性植株，Hpt基因陽性轉化率為0.24%。收獲6株轉基因植株種子。此次研究得到的轉基因植株較少，無法準確地進行表型鑒定。需要對后代進一步調查統計，研究脫水素在小麥中的作用，為進一步探索脫水素wzy1-2基因功能奠定基礎。