干旱脅迫對蒙原歐李光合特性及葉肉細胞超微結構的影響

邢鐘毓，李連國，郭金麗，張曉艷，李曉艷

(內蒙古農業大學園藝與植物保護學院，內蒙古 呼和浩特 010019)

歐李(Cerasushumilis(Bge). Sok)屬于薔薇科櫻桃屬，是我國特有的野生果樹之一，主要分布在我國東北、華北和西北干旱地區。歐李植株矮小，根系龐大，具有極強的水土保持、防風固沙能力，是我國三北地區植被恢復、生態建設的優良果樹樹種[1]。歐李果實營養豐富，尤其是鮮果含鈣量(79.09 mg·100g-1)為水果之冠，適合加工成果醬和果酒；種仁是正宗的中藥“郁李仁”；葉片可以制茶，具有較高的經濟價值。內蒙古高原是我國野生歐李資源最為豐富的地區，該地區歐李資源具有較為突出的抗旱和抗寒能力。蒙原歐李是內蒙古農業大學歐李科研團隊利用內蒙古高原歐李資源進行自然雜交、實生優選培育出來的抗寒抗旱優質豐產系列歐李新品系。

歐李抗旱性及抗旱機理研究受到專家學者們的廣泛關注。為了解析歐李的抗旱機理，研究人員采用不同試驗材料，通過干旱脅迫處理，測定得出多種生理指標、光合參數和葉綠素熒光變化有差異，最終均表明歐李具有極強的抗旱能力[2-4]。干旱脅迫導致植物光合作用降低，是因為葉片超微結構發生改變，而且超微結構的損傷程度與植物的耐旱性相關[5]。但在干旱脅迫下歐李光合作用變化規律與葉片超微結構的關系還沒有相關報道。本研究以蒙原歐李為試材，測定不同程度干旱脅迫下歐李葉片光合參數和葉綠素含量，觀察葉肉細胞超微結構的變化，分析蒙原歐李在干旱條件下光合作用下降的原因，為解析歐李抗旱生理機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

蒙原歐李2年生苗，材料來源于內蒙古農業大學歐李科研與示范基地。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料處理 選長勢一致的2年生健壯歐李苗，5月份定植于花盆中(上口徑×下口徑×高：25 cm×18 cm×20 cm)，基質配比為普通園土∶細沙=4∶1，每盆基質7.5 kg，每盆1株，放置于避雨大棚中養護，于生長旺期選取長勢一致的盆栽苗按試驗設計分批停水進行干旱脅迫處理，9月3號傍晚處理完成，次日上午9∶00-11∶00點集中采樣用于各項指標測定。試驗設置4個處理：輕度脅迫(LD)無澆水8 d；中度脅迫(MD)無澆水12 d；重度脅迫(SD)無澆水16 d；正常供水(CK)于8月18日傍晚澆透水，以后每4 d于傍晚少量補水一次(根據當天盆重減少情況)。每處理6盆，設置3次重復。

1.2.2 土壤含水量及葉片相對含水量測定 土壤含水量用烘干法測定：土壤含水量(SWC)=(M1-M2)/(M2-M0)×100%，其中，M0為烘干空鋁盒質量(g)；M1為烘干前鋁盒及土樣質量(g)；M2為烘干后鋁盒及土樣質量(g)。葉片相對含水量采用烘干法測定：葉片相對含水量(LRWC)=(M0-M1)/(M2-M1)×100%，其中，M0為葉片初始鮮重(g)；M1為葉片干重(g)；M2為葉片飽和鮮重(g)。

1.2.3 光合參數測定 在9月4日(晴天)上午9∶00-11∶00 采用便攜式光合作用測定系統(CIRAS-3，PP-System公司，美國)，選擇歐李植株生長健壯并完全展開的功能葉片(從植株頂端數第25～30片葉)，測定凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、氣孔導度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)和水分利用效率(WUE)。光源為LED，光合有效輻射PAR為1 200 μmol·m-2·s-1，每個處理3次重復。

1.2.4 葉綠素含量測定 葉綠素含量采用80%丙酮提取法[6]。

1.2.5 葉片超微結構觀測 取植株頂端數第25～30片新鮮葉片，分別切成大小約為0.5 mm×0.5 mm組織塊，迅速投入固定液(0.2 mol·L-1磷酸緩沖液配制2.5%戊二醛)4℃固定4 h。然后用PBS緩沖液沖洗3次，每次1 min。1%鋨酸4℃固定2 h后用PBS緩沖液沖洗3次，每次10 min。乙醇系列梯度(30%、50%、70%、90%、100%)脫水每次10 min，其中100%兩次。Epon812環氧樹脂包埋，37℃、45℃、65℃溫箱固化，每級溫度24 h。超薄切片機(Ultracut E，Reichert-Jung公司，奧地利)切片，醋酸雙氧鈾硝酸鉛染色。透射電鏡(JEM-1200EX，Jeol公司，日本)觀察，每個樣品取10個視野。

1.3 數據分析

采用Excel和SPSS軟件進行數據統計分析，采用單因素方差分析的最小顯著差異法(LSD)比較同一指標不同處理間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫對土壤含水量及葉片相對含水量的影響

隨著干旱脅迫程度加重，土壤含水量和葉片相對含水量變化趨勢一致，隨干旱脅迫時間的延長逐漸降低(圖1)。不同處理間差異均達到了顯著水平，其中SD處理降幅最大，土壤含水量和葉片相對含水量分別降為CK的21.60%和78.21%(P<0.05)。蒙原歐李在SD處理時依然能保持較高的葉片相對含水量，這與其特殊的葉片結構有關，蒙原歐李葉片狹窄，葉片小而厚，氣孔密度大但氣孔較小，水分散失的少。

2.2 干旱脅迫對蒙原歐李葉片光合參數的影響

隨著干旱脅迫程度的加重，蒙原歐李各光合參數變化趨勢明顯(圖2)。Pn、Tr、Gs、WUE變化趨勢一致，即隨著干旱脅迫程度的加重各參數值逐漸降低；除Gs在MD處理和SD處理之間差異不顯著外，其他參數在不同脅迫處理條件下各處理間均差異顯著(P<0.05)。Pn在MD處理時降幅最大，較LD處理下降63.11%，在SD處理時降到最低，為CK的9.09%，說明此時光合作用產生的能量與呼吸消耗的能量基本持平。Tr、WUE與Gs均在SD處理下最低，分別為CK的45.19%、20.39%和3.16%，說明隨著脅迫程度的逐漸加重，歐李葉片通過關閉氣孔來降低蒸騰速率，以保持葉片水分來抵抗不良環境，這也是歐李植株抗旱的一種表現。

注：圖中不同小寫字母代表在 0.05 水平上差異顯著，下同。Note：Different lowercase letters in the figure represent significant differences at the level of 0.05. The same below.圖1 蒙原歐李在不同干旱脅迫程度下土壤含水量及葉片相對含水量的變化Fig.1 Changes of soil water content and relative water content of leaves in Mengyuan Cerasus humilis under different drought stresses

圖2 蒙原歐李在不同干旱脅迫程度下光合參數的變化Fig.2 Changes of photosynthetic parameters of Mengyuan Cerasus humilis under different drought stresses

Ci與其他光合參數變化趨勢相反，隨干旱脅迫程度的加重呈逐漸上升趨勢。LD處理與CK相比，差異不顯著，說明在LD處理下光合機構仍能正常運作；但隨著干旱脅迫時間的延長，Ci顯著升高，在SD處理時到達最高值，是CK的2倍，而此時Gs達到最低值，說明在SD處理下大部分氣孔已經關閉，Ci仍急劇升高可能是由于光合機構受損失去了正常的運作能力。

2.3 干旱脅迫對蒙原歐李葉綠素含量的影響

隨著脅迫程度的加重，蒙原歐李葉片葉綠素含量先升后降，各處理間差異顯著(P<0.05)(圖3)。在LD處理下，蒙原歐李對不良環境出現應激反應，葉片水分減少，葉綠素呈現相對“濃縮”，此時含量達到最高值(3.10 mg·g-1)，與CK相比增加6.59%；隨干旱脅迫加重，水分缺失導致蒙原歐李葉片細胞生理機能發生改變，葉綠素合成減少或受阻，分解加快，因此葉綠素含量迅速降低，SD處理下葉綠素含量降至最低(2.77 mg·g-1)。

2.4 干旱脅迫對蒙原歐李葉肉細胞超微結構的影響

2.4.1 干旱脅迫對細胞核超微結構的影響 干旱脅迫程度加大使蒙原歐李葉肉細胞細胞核變的不規則，染色質濃縮，甚至解體消失。CK細胞核呈球形，結構完整，雙層膜完整清晰，核質均勻(圖4A)；LD處理下細胞核變為不規則球形，核膜清晰，核膜內陷，核質均勻一致(圖4C)；MD處理下核質濃縮，核膜變形，外膜模糊，出現部分斷裂(圖4E)；SD處理下細胞核失去正常結構，嚴重變形、變小，核膜出現大面積溶解，核內物質流出，幾乎解體(圖4G)。

圖3 蒙原歐李在不同干旱脅迫程度下葉綠素含量變化Fig.3 Changes of chlorophyll content in Mengyuan Cerasus humilis under different drought stresses

注：N：細胞核；NH：核膜；CW：細胞壁；PM：細胞質膜；CH：葉綠體；CM：葉綠體膜；Mi：線粒體；G：基粒；SG：淀粉粒；V：液泡；OG：嗜鋨顆粒。(A)正常供水細胞核結構×50000；(B)正常供水葉綠體及線粒體結構×50000；(C)輕度脅迫細胞核結構×30000；(D)輕度脅迫葉綠體及線粒體結構×50000；(E)中度脅迫細胞核結構×30000；(F)中度脅迫葉綠體及線粒體結構×50000；(G)重度脅迫細胞核及線粒體結構×30000；(H)重度脅迫葉綠體結構×30000。Note: N： Nucleus；NH： Nuclear hole；CW: Cell wall；PM: Plasma membrane；CH: Chloroplast；CM：Chloroplast membrane；Mi： Mitochondria；G： Grana；SG： Starch grain；V： Vacuole；OG： Osmiophilic granule。(A)The structure of nucleus under normal water supply×50000； (B) The structure of chloroplast and mitochondrial under normal water supply×50000； (C) The structure of nucleus under mild stress×30000; (D) The structure of chloroplast and mitochondrial under mild stress ×50000; (E) The structure of nucleus under moderate stress×30000； (F) The structure of chloroplast and mitochondrial under moderate stress×50000; (G) The structure of nucleus and mitochondrial under severe stress×30000; (H) The structure of chloroplast under severe stress×30000.圖4 蒙原歐李在不同干旱脅迫程度下葉肉細胞超微結構變化Fig.4 Ultrastructural changes of mesophyll cells in Mengyuan Cerasus humilis under different drought stresses

2.4.2 干旱脅迫對細胞壁的影響 隨干旱脅迫程度增大，蒙原歐李葉肉細胞細胞壁先厚后薄。LD處理下細胞壁最厚(700 nm)，比CK(680.58 nm)厚19.42 nm，MD和SD處理時細胞壁厚度均小于CK，分別為629.42、500 nm。CK及LD處理時細胞壁和質膜清晰，細胞未發生質壁分離(圖4B,4D)；MD處理時，部分細胞質膜內陷，出現質壁分離(圖4F)；SD處理時質壁分離嚴重，細胞器崩潰降解(圖4H)。

2.4.3 干旱脅迫對葉綠體超微結構的影響 蒙原歐李葉肉細胞葉綠體隨干旱脅迫程度加大變化明顯，逐漸失去完整結構。CK葉綠體結構完整，呈梭形沿其長軸方向分布于質膜內側，雙層被膜結構清晰完整，基粒片層垛疊整齊有序(圖4A，4B)；LD處理下其排列整齊但有輕微腫脹現象，部分基粒類囊體變松散，基粒片層間距變寬，但片層結構清晰可辨，含較多淀粉粒和少量嗜鋨顆粒(圖4C，4D)；MD處理下葉綠體加劇膨脹，由梭形向圓形變化，外膜模糊，基質片層被拉長變細出現斷裂離散現象，呈絲狀片層結構，嗜鋨顆粒數明顯增多、體積變大，有較多大體積淀粉粒，個別葉綠體彎曲有脫離質膜內側移向細胞中央的趨勢(圖4E，4F)；SD處理下葉綠體進一步腫脹變形并脫離質膜內側，內部出現空腔，膜系統結構幾乎解體，淀粉粒數量減少，大量嗜鋨顆粒流入細胞質(圖4G，4H)。

2.4.4 干旱脅迫對線粒體超微結構的影響 隨干旱脅迫程度增大，線粒體整體結構變化不大，大部分未見明顯破裂。CK線粒體呈圓球或橢球形隨機散布在細胞質中，雙層膜結構完整，嵴豐富明顯，基質濃厚(圖4B)；LD處理下嵴出現一定程度斷裂(圖4D)；MD處理下線粒體膜發生斷裂溶解，嵴部分斷裂，內腔出現空洞，線粒體變得模糊(圖4F)；SD處理下外膜幾乎消失，嵴嚴重減少且基質變稀薄，線粒體模糊不清幾近消失(圖4G)。

3 討論與結論

土壤干旱脅迫對植物生長和代謝的影響是多方面的，其中對光合作用的影響尤其突出和重要[7]。從植物本身來說，干旱脅迫導致光合作用的降低受到氣孔與非氣孔因素的雙重影響[8-10]。研究普遍認為，植物在短期逆境條件下光合作用降低主要是氣孔限制的作用，植物在干旱脅迫下，為了降低蒸騰作用、保持水分而關閉氣孔，從而使Gs降低，蒸騰速率降低，進而引起光合速率的降低[11]。本研究也驗證了這個結論，蒙原歐李在LD處理下，Gs下降，葉片氣孔關閉以減少蒸發，同時阻礙了外界CO2進入葉肉細胞，Ci變化不明顯，導致蒙原歐李Pn降低，這說明此時光合作用的受限主要是由氣孔限制引起的。隨著脅迫加重，在MD和SD處理下Gs顯著降低，但二者差異不顯著，而此時Ci顯著上升，在SD時達到CK的2倍，Pn降至最低值。說明干旱脅迫程度進一步加重時，氣孔不是光合作用降低的決定性因素，蒙原Pn降低可能是因為葉綠體和線粒體光合機構受損無法進行正常的光合作用引起的。為了進一步證實這一結論，對干旱脅迫下的蒙原歐李葉綠素含量進行了測定，結果發現葉綠素含量先升后降，LD時達到最高值，較CK增加了6.59%，這可能是通過增加葉綠素合成保護光合機構不受破壞，維持葉片正常光合作用來抵抗逆境，是蒙原歐李具有較強的抗旱能力的體現。但隨脅迫程度加重，葉綠體結構發生變化，葉綠素含量下降，這也是導致光合作用降低的主要原因之一。本研究結論與一些學者研究結果一致，如楊銳等[12]在野生酸棗上的研究，也發現在干旱脅迫下葉綠素含量先升后降，但還有些研究認為葉綠素含量會隨著干旱脅迫程度的加深而減少[13]，這可能與研究物種的抗旱能力有關，蒙原歐李和野生酸棗都是抗旱植物的典型代表。

葉綠素含量和光合參數的變化，究其主要原因就是在不同的干旱脅迫處理條件下，植物葉片葉肉細胞超微結構發生不同程度的變化，其中葉綠體和線粒體是對脅迫較敏感且所擔負功能較為重要的兩個細胞器[14]。本研究發現，在CK處理下葉肉細胞中的葉綠體呈梭形緊貼于細胞壁，葉綠體這種分布方式有利于大氣中的CO2向葉綠體中擴散，促進光合作用[15]。隨干旱脅迫程度加重，蒙原歐李葉綠體移向細胞中央，由梭形逐漸腫脹變形，基粒片層結構紊亂，雙層膜破裂，出現空腔，內容物流出，嗜鋨顆粒和淀粉粒明顯增多，而葉綠體這些形態變化證明蒙原歐李在干旱脅迫嚴重時光合機構遭到破壞，導致光合作用降低。與葉綠體相比，線粒體是細胞中較不敏感的細胞器，受害程度較小[16-17]。研究發現，只有在MD和SD處理下蒙原歐李線粒體結構才會遭到破壞，功能降低甚至消失，不能提供轉運碳水化合物所需的能量，影響葉綠體光合產物輸出，進而導致大量淀粉累積在葉綠體內，形成淀粉顆粒；當葉片中淀粉顆粒量達到一定水平時，淀粉會對類囊體造成機械損傷，引起葉綠體光合速率和光合活性降低[18]。葉綠體和線粒體損傷意味著新陳代謝發生紊亂，引起光抑制，導致光合能力下降，這也是蒙原歐李隨著干旱脅迫程度加重光合作用降低的因素之一。

此外，我們研究發現蒙原歐李葉肉細胞在LD處理下的細胞壁厚度(700 nm)要明顯高于CK(680.58 nm)、MD處理(629.42 nm)和SD處理(500 nm)，這可能是蒙原歐李在遇到外界環境脅迫時所做出的適應環境的改變，也是歐李抗旱性強的一種表現。吳建慧等[19]在委陵菜屬植物研究中也發現干旱脅迫后有細胞壁增厚的現象，但未報道細胞壁厚度與植物抗逆性是否相關，因此需要進一步對蒙原歐李其他品種或資源進行綜合分析，準確得出細胞壁增厚能否作為評價歐李抗旱性指標之一的結論。