慢病毒介導的RNA干擾抑制白血病細胞增殖的應用

方金勇， 王 雍， 張熠玲， 王志龍， 徐玲玲， 趙鐵軍

(浙江師范大學 化學與生命科學學院,浙江 金華 321004)

慢病毒載體是以人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)基因組為基礎，人工改造構建而成的一種病毒載體.它利用病毒高感染性、高表達性、可感染分裂細胞和非分裂細胞等諸多特性，經過感染細胞或組織，從而實現外源基因持續穩定的表達[1].應用最為廣泛的慢病毒載體系統包含整合質粒、包裝質粒和包膜質粒.前者主要含有包裝、逆轉錄及整合所必需的作用原件，且具有多克隆位點及插入到該位點的目的基因；后二者構成了慢病毒載體的包裝系統，提供了慢病毒包裝所需的蛋白質外殼部分.在慢病毒載體構建過程中，將整合質粒、包膜質粒和包裝質粒3種質粒混合，轉染包裝細胞后，培養收集得到所需的慢病毒載體.

RNA干擾(RNA interference,RNAi)是生物進化中一項保守的防御機制，它是由雙鏈RNA誘發同源mRNA發生特異性降解的過程[2].在細胞中，雙鏈RNA(double stranded RNA,dsRNA)經過核糖核酸內切酶(endonuclease)剪切形成大小為21～26 bp的siRNA，隨后siRNA與其他復合物結合，形成RNA誘導沉默復合物(RNA induced silencing complex,RISC)，在siRNA反義鏈的指導下，RISC結合到與其互補的轉錄產物上，最后特異性地降解目的RNA的過程[3-5].慢病毒載體介導的RNAi利用慢病毒載體將RNAi片段導入宿主細胞，從而抑制同源mRNA的表達.該方法將慢病毒載體的高感染性、高表達性與RNAi的特異性相結合，與其他方式相比，前者具有可使目的基因產生持續穩定沉默等顯著優點[6-7].

成人T細胞白血病是一類由成人T細胞白血病病毒(human T cell leukemia virus type-1,HTLV-1)感染引起的惡性腫瘤[8-9]，研究者在2002年發現,HTLV-1反義鏈編碼的HBZ蛋白與該病發生有密切關系[10-13].研究發現,所有ATL病人樣品中均能檢測到HBZ基因的表達，而且HBZ是HTLV-1編碼產物中唯一一個不存在無義突變的基因.HBZ的持續表達增強了HTLV-1感染細胞的惡性增殖能力.此外，HBZ轉基因鼠呈現全身性炎癥反應，且該轉基因鼠的T細胞淋巴瘤發生率明顯高于正常小鼠[14]，這表明HBZ的持續表達在ATL發病機制中占有重要的意義.

為了探索治療成人T細胞白血病的方法，實現抑制白血病細胞增殖的目的，研究首先構建了表達HBZsiRNA的慢病毒載體，將其感染白血病細胞后發現，慢病毒載體介導的RNAi能明顯下調白血病細胞內HBZ的表達，并且白血病細胞的惡性增殖受到了顯著抑制.該研究結果為利用慢病毒載體介導的RNAi治療ATL疾病提供了實驗依據和工具.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

包裝慢病毒載體的3個質粒，即表達質粒pCSⅡ-U6-MCS-PCMV-EGFP、包裝質粒pCMV-Δ8/9和包膜質粒pcDNA-VSVG由日本京都大學松崗雅雄教授惠贈；293FT細胞(人胚腎細胞)、白血病細胞株TL-Om1同樣來自于松崗雅雄教授；HBZsiRNA片段及PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；Taq酶及緩沖液購置于TaKaRa公司；質粒提取試劑盒及凝膠純化試劑盒均為Promega公司產品；Anti-HBZ抗體由美國教授Green提供；細胞培養基DMEM、RPMI-1640及脂質體Lipofectamine 2000為Invitrogen公司產品；二次抗體購自于Santa Cruze公司；四季青胎牛血清(FBS)來自浙江天杭生物科技有限公司；其他試劑均為國產分析純.

1.2 慢病毒載體的構建

根據NCBI網站(http://www.ncbi.nlm.nuh.gov/)提供的HTLV-1HBZ序列(GenBank Accession編號:DQ273132.1)，使用在線siRNA設計網站siDirect 2.0版(http://sidirect2.rnai.jp/)設計HBZsiRNA序列.HBZsiRNA序列：正義鏈為5′-AGGACAAGGAGGAGGAGGATTCAAGAGATCCT-CCTCCTCCTTGTCCTTTTTTT-3′；反義鏈為5′-AATTAAAAAAAGGACAAGGAGGAGGAGGATCT-CTTGAATCCTCCTCCTCCTTGTCCTGGCC-3′.對照組序列：正義鏈為5′-AGAGGCTTAGGCTTAACCTTAAGAGTTCCTTCCTTCCTTAGAGTTAGGAGCCG-3′；反義鏈為5′-AATTTCTCCGAATCCGAATTGGAATTCTAAGGAAGGAAGGAATCTCAATCCTCG-GCGGCC-3′.上述序列由上海生工合成.室溫下將正義鏈與反義鏈退火粘連形成雙鏈siRNA.隨后將siRNA與酶切后的線性載體連接，轉化至JM109感受態細胞.挑取菌落，經菌落PCR和酶切電泳鑒定陽性克隆后，送往生物公司測序.

1.3 慢病毒的包裝和滴度測定

慢病毒質粒轉染按脂質體轉染法操作，其中重組質粒pCSⅡ-U6-MCS-CMV-EGFP-HBZ siRNA 15 μg，包裝質粒pCMV-Δ8/9 15 μg和包膜質粒pcDNA-VSVG 7.5 μg在脂質體Lipofectamie 2000的介導下，轉染至293FT細胞.48 h后，收集細胞上清液，經過0.22 μm濾器過濾后，28 000 r/min，4 ℃離心2 h收獲沉淀，再使用400 μL 1640+10% FBS+P/S培養基重懸，獲得病毒濃縮液.取20 μL病毒濃縮液加入到12孔板中感染293FT細胞.培養4 d后，利用熒光顯微鏡觀察GFP熒光細胞數并折算為病毒感染滴度(PFU/mL).

1.4 病毒顆粒感染細胞

感染當天，收集TL-Om1細胞調整細胞密度為1×106個/mL，加入適當Polybrene使其終濃度為3～5 μg/mL，然后將細胞接種于12孔板，每孔體積為1 000 μL.取20 μLHBZsiRNA慢病毒和對照組siRNA慢病毒濃縮液分別加入到12孔板中，輕輕混勻，置于培養箱.48 h后，使用熒光顯微鏡檢測綠色熒光蛋白的表達，確定病毒感染效率.

1.5 感染細胞中HBZ表達水平的檢測

1.5.1 RT-PCR檢測HBZ基因表達水平

用Trizol提取病毒感染后的TL-Om1細胞總RNA，對其進行RNA純化及逆轉錄，運用PCR檢測HBZ轉錄情況.HBZ基因引物上游：5′-TAAACTTACCTAGACGGCGG-3′，下游：5′-CTGCCGATCACGATGCGTTT-3′.內參為GAPDH的引物上游：5′-GCAGGGGGGAGCCAAAAGGG-3′，下游：5′-TGCCAGCCCCAGCGTCAAAG-3′.PCR反應條件為：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性20 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，最后72 ℃延伸5 min.PCR產物用于2%瓊脂糖凝膠電泳檢測.

1.5.2 Western blot定量分析HBZ蛋白表達水平

使用RIPA細胞裂解液提取HBZsiRNA組和Control siRNA組細胞的總蛋白，使用考馬斯亮藍法進行蛋白定量分析，取100 μg蛋白變性.將變性后蛋白以每孔20 μg總蛋白樣進行SDS-PAGE電泳，電泳結束后按半干轉膜法轉膜(PVDF膜)，5%的脫脂奶粉中封閉2 h，一抗孵育，按抗體說明書上的最佳稀釋濃度稀釋加一抗(1∶2 000稀釋)，4 ℃于冰箱孵育過夜，PBST洗膜3次，每次10 min，再加入稀釋好的熒光二抗(1∶2 000稀釋)，室溫孵育2 h，PBST洗膜3次，每次10 min，暗室曝光.

1.6 MTT法檢測轉染細胞的增殖

取對數生長期的病毒感染后的TL-Om1細胞制成細胞懸液，細胞計數板計數后，將細胞稀釋至1×105個/mL細胞密度，按100 μL/孔接種細胞于96孔板，每組做3～4個復孔；然后分別繼續培養細胞(0，24，48，72 h)后，按照10 μL/孔的量加入濃度為5 mg/mL的MTT溶液，繼續放入培養箱連續孵育4 h；4 h后使用排槍吸取100 μL/孔室溫酸化異丙醇裂解液加入到孔板中，吹打混勻；室溫避光靜置10 min后，放入酶標儀連續振蕩3 s，在595 nm波長下檢測吸光值(即OD值)，分析細胞生長情況.

1.7 RT-PCR檢測細胞生長相關基因表達情況

RNAi后提取TL-Om1細胞的總RNA.運用PCR技術檢測基因表達情況.PCR產物用于2%瓊脂糖凝膠電泳檢測.

2 結 果

2.1 構建HBZ siRNA慢病毒重組載體

為了將HBZsiRNA 片段連接入慢病毒重組載體，需要將載體進行線性化處理.如圖1所示，pCSⅡ-U6-MCS-CMV-EGFP質粒經ApaⅠ和EcoRⅠ雙酶切后，運用凝膠純化試劑盒純化酶切產物，凝膠電泳后得到10.2 kb大小的線性化條帶，符合預期結果，為下一步連接反應提供材料(見圖1).

公司合成的HBZsiRNA進行退火處理形成雙鏈siRNA.利用DNA連接酶將酶切后的pCSⅡ-U6-MCS-CMV-EGFP線性質粒與雙鏈的HBZsiRNA

圖1 pCSⅡ-U6-MCS-CMV-EGFP質粒Apa Ⅰ和EcoR Ⅰ雙酶切產物鑒定圖

片段4 ℃過夜連接得到重組質粒.重組質粒轉化大腸桿菌后，運用菌落PCR鑒定重組質粒(見圖2).PCR產物均為1.2 kb左右的目的片段，與預期相符.這表明siRNA與載體連接成功，且方向正確.為了進一步驗證該結果，重組質粒經EcoRⅠ酶切后，檢測結果與預期相符(見圖3).經生物公司測序后，表明插入片段序列正確.上述結果表明，pCSⅡ-U6-MCS-CMV-EGFP-HBZ siRNA重組質粒構建成功.

M:DNA marker；1—12：重組質粒

M:DNA marker；1—6：重組質粒

2.2 HBZ siRNA慢病毒包裝及滴度測定

重組質粒pCSⅡ-U6-MCS-pCMV-EGFP-HBZsiRNA提取純化后，與包裝質粒pCMV-Δ8/9和包膜質粒pcDNA-VSVG共轉染293FT細胞.通過熒光顯微鏡觀察發現98%以上的細胞表達綠色熒光蛋白GFP，表明慢病毒載體在293FT宿主細胞中包裝效率極高(見圖4).慢病毒包裝48 h后收集并濃縮病毒顆粒，滴度測定結果顯示,該慢病毒病毒滴度為1×108PFU/mL，表明本實驗獲得足

A：對照組中GFP的表達情況；B：DAPI熒光染色法檢測對照組細胞；C：實驗組中GFP的表達情況；D：DAPI熒光染色法檢測實驗組細胞

量病毒，能滿足后續感染實驗的要求.

2.3 RT-PCR檢測siRNA對TL-Om1細胞中HBZ mRNA表達的抑制效果

表達HBZsiRNA的病毒懸液與一定量的Polybrene混合后加入TL-Om1細胞培養基中，細胞經離心后轉移至12孔板培養.48 h后，收集Control siRNA組和HBZsiRNA組細胞，提取RNA，并運用RT-PCR的方法檢測HBZ的表達.PCR產物經電泳檢測后發現，HBZsiRNA組中HBZ的表達明顯低于實驗對照組，表明慢病毒介導的RNAi感染有效地抑制了HBZ基因的表達(見圖5).

24,26,28 指的是PCR的循環次數

2.4 Western blot檢測siRNA對 TL-Om1細胞中HBZ蛋白表達的抑制效果

收集對照組和實驗組的TL-Om1細胞，裂解細胞提取總蛋白，運用Western blot檢測HBZ蛋白的表達情況.如圖6所示，與Control siRNA相比，感染HBZsiRNA病毒的TL-Om1細胞內HBZ蛋白表達水平明顯降低.

圖6 表達質粒轉染TL-Om1細胞Western blot結果

2.5 MTT法檢測TL-Om1細胞生長

慢病毒感染白血病細胞TL-Om1后，將對照組和實驗組細胞接種于96孔板，24,48,72 h后采用MTT法檢測細胞的生長情況，繪制生長曲線.與對照組相比，TL-Om1細胞感染表達HBZsiRNA的慢病毒后，隨著培養時間的增加，實驗組細胞生長活力較對照組明顯受到抑制(見圖7).

圖7 TL-Om1細胞生長曲線

2.6 RT-PCR檢測RNA干擾后細胞生長相關基因的表達

表達HBZsiRNA的慢病毒感染TL-Om1細胞72 h后，運用RT-PCR技術檢測細胞生長相關基因的表達情況.與對照組相比，實驗組TL-Om1細胞內腫瘤細胞生長相關基因如E2F1，PCNA，Myc等的表達受到明顯的抑制(見圖8).

圖8 RNAi后RT-PCR檢測細胞生長相關基因表達情況

綜上所述，慢病毒介導的siRNA方法有效地下調了HTLV-1關鍵蛋白HBZ的表達，從而下調細胞生長相關基因的表達，最終抑制了白血病細胞的惡性增生.

3 討 論

3.1 慢病毒介導的RNAi在腫瘤治療中的運用

由于慢病毒介導的RNA干擾技術能持久、穩定、特異性地抑制腫瘤細胞中關鍵致癌基因的表達，且不易誘發宿主免疫反應[15]，為腫瘤治療提供一個新的技術手段，已成為生物醫學領域的新熱點[16].例如，CXCL12/CXCR4被證實是惡性腫瘤的一個重要標志物，在食管鱗狀細胞癌(ESCC)中也檢測到該基因的高表達[17-18]，Wang等[19]利用慢病毒載體介導的siRNA技術沉默了ESCC細胞中CXCR4基因的表達.結果顯示，CXCR4基因受到抑制后，細胞凋亡相關基因Bcl-2的表達下降，細胞的生長明顯被抑制并且凋亡增加，而且該慢病毒也有效地抑制了小鼠體內腫瘤的增殖.這為食管鱗狀細胞癌的治療提供了新的方法.在體內治療中，Akhtar等[20]發現慢病毒介導的RNAi技術下調了在胃癌細胞增殖過程中具有重要作用的stathmin1基因的表達，有效地抑制了人胃癌細胞生長和轉移.上述研究證實，慢病毒介導的RNAi技術對抑制腫瘤細胞的惡性是切實有效的.

3.2 ATL臨床治療的方法及局限性

成人T細胞白血病是一種惡性的淋巴系統疾病[21].當前治療ATL常用的方法有聯合化學療法、異基因骨髓干細胞移植、分子靶向藥物等[22]，但是ATL患者的治愈情況依舊不容樂觀，而且其預后效果不理想.這主要原因在于：1)在長期使用藥物后，ATL細胞容易產生耐藥性；2)ATL病人呈現免疫缺陷狀態，易于遭受機會性感染；3)異基因骨髓干細胞移植方法(allo-SCT)[23]使病人機體處于一種免疫缺陷狀態，若治療中移植感染HTLV-1的供體細胞，仍可導致病人淋巴瘤的發生.因此，探索一種能有效避免傳統療法帶來負面效果的新型治療手段成為攻克該疾病的關鍵.

3.3 慢病毒介導的siRNA在治療ATL中的可行性

HTLV-1病毒編碼蛋白在ATL發生過程中扮演極其重要的作用.探索直接以HTLV-1病毒蛋白為靶點，選擇性抑制關鍵基因，從而遏制腫瘤生長的新型治療方法，可以避免傳統治療方式造成的機體免疫缺陷和化療的毒副作用等缺陷.HBZ病毒蛋白是導致ATL的關鍵因素，實驗研究結果表明，慢病毒介導的RNA干擾可以成功抑制HBZ的表達，從而有效降低了ATL細胞的惡性增生，并且白血病細胞內一些與細胞生長相關基因的表達也受到明顯抑制，這為治療ATL提供了有效可行的方法.此外，慢病毒載體是一類較為成熟的基因轉移載體系統，其在基因治療中的運用非常廣泛.在美國FDA批準的基因治療計劃中，半數以上的計劃都是運用慢病毒載體攜帶治療性藥物導入靶細胞，從而實現藥物的持久長效表達，而且載體可以大量生產，因此，其應用性和市場極為廣泛.我們有理由相信慢病毒介導的RNAi技術作為一種有效的基因治療手段，必將從目前的體外實驗走向更具有實用意義的體內實驗，以HBZ為靶點的基因治療將在ATL的治療中開創更廣闊的臨床應用.