2株柴油降解菌的分離篩選及生長特性分析

周宏飛， 陳 瑋， 楊鑫星， 辛德東， 鞏菊芳， 孫梅好

(浙江師范大學 化學與生命科學學院,浙江 金華 321004)

0 引 言

油烴類污染物已被列為環境中應優先控制、潛在危險性大的毒害性污染物，即優先控制污染物(priority pollutants)[1].在油烴類污染物中，柴油是一類烷烴和芳香族化合物的復雜混合物，常通過儲罐或管道泄漏造成土壤污染[2].柴油污染土壤后會影響土壤的通透性、微生物的生長及植物根系發育等，致使作物減產[3].

柴油污染土壤的修復方法主要有物理修復、化學修復、微生物修復及植物修復等[3].物理和化學修復法通常存在費用昂貴、造成二次污染及修復范圍有限等缺點，而微生物修復具有費用低、環境友好、操作便捷等優點[2-4].微生物修復從原理上可分為生物強化、生物刺激及生物通風3個方面，其中生物強化是指在污染土壤中加入相應降解菌以提高有機物的降解[2].目前，有關降解菌的研究主要包括降解菌的篩選、生長特性分析、生物表面活性劑鑒定及降解機制的研究等.科學家已從污染的空氣、土壤、海水中篩選了不同的降解菌，包括細菌、真菌等，并對柴油降解的機理進行了深入探討[5-6].生物表面活性劑可通過與細胞膜作用增加細胞表面的疏水性，使細胞易獲取疏水性物質，還可通過降低油與水的界面張力，增加不溶物的表面積，從而提高油烴的流動性及生物利用度[6]，所以生物表面活性劑可有效提高降解菌的降解效率.因降解菌合成生物表面活性劑受碳源、氮源、培養條件(溫度、鹽度、pH等)的影響[7]，分析降解菌的生長及降解條件可有效提高菌株油污降解的性能.篩選優異柴油降解菌，并優化其生長、降解條件，能進一步促進微生物修復在柴油污染修復中的應用.

目前，微生物修復主要應用在海洋、油田等大型污染區域，在加油站、汽車修理廠等附近的污染區域未見微生物修復報道.加油站等的油烴類污染物可以橫向或縱向地污染周圍的土壤，由于受選擇性壓力的影響，這些土壤中會存在一些高效利用油烴類化合物的菌株.從加油站及修車廠周圍的柴油污染土壤樣品中篩選出EGY和GY2株柴油降解菌，通過單因素分析優化了培養參數，并設計了EGY在不同柴油濃度下的柴油降解實驗及土壤柴油降解實驗，結果表明，EGY可高效降解污染土壤中的柴油，為柴油降解菌的實際應用奠定了一定基礎.

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

柴油(0#)購自中石化；酵母提取物、胰蛋白胨、氨芐青霉素均購自賽默飛世爾科技公司；溶菌酶、細菌DNA提取試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司；DNA Marker,10×PCR Loading Buffer,Primes STARTMHS DNA Polymerase,5×Prime STARTMBuffer,dNTP Mixture(2.5 mmol/L),SolutionⅠ購自大連寶生物工程有限公司；細菌基因組通用引物由上海生工生物技術服務有限公司合成；其他常規生化試劑均為購自金華醫藥有限公司的分析純試劑.

1.2 培養基

參見文獻[8]配置柴油培養基.柴油濃度在液體培養基中為體積比，在土壤中為質量比.牛肉膏蛋白胨培養基、LB培養基均用去離子水配置.

1.3 柴油降解菌的富集和分離

1.3.1 采 樣

挖取加油站卸油口附近的土壤、加油站中被柴油污染的土壤、加油站中被柴油污染的沙子、修車廠附近土壤分別裝于50 mL滅菌離心管中.

1.3.2 土壤樣品預處理

稱取3.0 g樣品，加入到已滅菌的裝有90 mL蒸餾水的250 mL錐形瓶中，浸泡、攪拌，室溫下密閉靜置24 h，上清液即為菌源.

1.3.3 菌株的富集及分離

從各菌源中各取1 mL加入到100 mL柴油液體培養基中(1%，0#柴油)30 ℃,220 r/min搖床培養24 h.待培養液渾濁后，移取1 mL培養液于裝有100 mL新鮮柴油培養基的250 mL錐形瓶中，相同條件下連續富集3次.

將富集培養好的菌懸液以不同梯度進行稀釋，并在固體柴油培養基上涂布分離，30 ℃培養12 h，挑取生長狀態較好的單菌落在固體柴油培養基中30 ℃培養6 h，相同條件下重復3次，得到分離后的菌株.各菌株在柴油無機培養基中培養24 h后，儲存于-80 ℃冰箱中待用.

1.4 柴油降解菌的鑒定

細菌的革蘭氏染色法鑒定參照胡勇等[9]的實驗方法.細菌基因組DNA提取試劑盒方法提取細菌DNA，利用16S rDNA引物(Eubac 27F,Eubac 1492R)擴增片段，并測序.所得序列利用EzTaxon(http://www.ezbiocloud.net/eztaxon/)進行物種分析，利用MEGA7軟件[10]進行系統發育分析，選擇鄰接法(Neighbor joining)[11]構建系統發育樹.系統發育樹評估采用Bootstrap法[12]，置信值估算重復次數1 000次(支持率高于50%的在圖上顯示).進化距離通過Kimura 2參數模型計算[13].

1.5 柴油降解菌的生長環境優化

在柴油無機培養基中，利用單因素分析確定并優化EGY和GY單獨生長的最佳條件(溫度、pH、含油量、鹽度).各菌株進行4組單因素變量實驗，每組處理重復5次，培養48 h后離心收集菌體加等量無菌水充分懸浮后，利用分光光度計(CARY 4000，Aglent，USA)進行OD600測定.

1.6 EGY降解油污能力的測定

1.6.1 柴油無機鹽培養基接菌

在含有不同柴油濃度的100 mL無機培養基中接種1 mL菌液及1 mL無菌水作為對照組，30 ℃,220 r/min搖床培養24 h后離心，取全部上清用于柴油含量測定，每組重復3次.

1.6.2 土壤接菌

取3個規格一致的花盆編號1—3，每盆中裝入400 g滅菌土壤和0.4 g柴油后混勻，在1和2號花盆中接入1%的EGY菌種，1號花盆的土壤環境調至該菌最適鹽度，2號花盆不調鹽度，均在25 ℃下無菌封閉培養10 d；3號花盆未接菌作為對照組，在25 ℃下未封閉放置進行自然降解.

1.6.3 紅外分光光度法測定柴油降解

柴油提取及含量測定方法參照2012年環境保護部頒布的《水質石油類和動植物油類的測定紅外分光光度法》.根據方法測定校正系數X，Y，Z和F，根據式(1)計算總油含量，由式(2)計算芳香烴含量.取無機培養基上清用CCl4萃取2次，每次3 mL，得待測樣品.土壤實驗中，培養期間多次取樣，1 g土樣用40 mL CCl4萃取3次，得待測樣品.利用紅外分光光度計(670 FT-IR，NEXUS，USA)測定樣品中各組分濃度，并計算降解率.

ρ總油=X·A2 930+Y·A2 960+Z(A3 030-A2 930/F)；

(1)

ρ芳香烴=Z(A3 030-A2 930/F).

(2)

式(1)和式(2)中：ρ為含量(mg/L)；A2 930,A2 960,A3 030對應波長下的吸光值；X,Y,Z對應C-H鍵的校正系數；F為脂肪烴對芳香烴影響的校正因子.求得結果后通過Student′s t-test求得P值，“*”P<0.05表示統計學上有顯著性差異；“**”P<0.01表示統計學上有極顯著性差異.

2 結 果

2.1 柴油降解菌的分離篩選及鑒定

樣品經富集、分離篩選及純化后，得到2株以柴油為碳源的柴油降解菌，將其分別命名為EGY和GY.菌株的表面形態觀察和革蘭氏染色結果表明,EGY為革蘭氏陽性菌，菌落為黃色，邊緣光滑、不透明，菌斑圓形，表面濕潤黏稠；GY為革蘭氏陰性菌，菌落為白色，邊緣光滑、中央透明，菌斑圓形，表面濕潤.通過16S rDNA測序和進化樹分析表明，EGY為瓊氏不動桿菌(Acinetobacterjunii)(見圖1).GY與鞘脂菌屬的Sphingobiumlactosutens及Sphingobiumchungbukense在進化樹上可以聚為一支，這表明，GY是鞘酯菌的一個新種(見圖2).

2.2 菌株生長條件分析

2.2.1 溫度對菌生長的影響

溫度可以影響營養物質的溶解度、酶活性、細胞膜流動性等,從而影響細胞的生長及物質運輸.故探究菌株最適溫度有利于優化其降解柴油能力.2種菌株于柴油無機鹽培養基(pH 7.0、柴油量為1%)中20，25，30，35和40 ℃下培養，結果表明，EGY和GY生長的最適溫度分別為25，35 ℃，且在該范圍內二者均有一定的生長能力(見圖3).

圖1 鄰接法構建菌株EGY的16S rRNA基因系統發育樹

圖2 鄰接法構建菌株GY的16S rRNA基因系統發育樹

圖3 溫度對EGY和GY生長的影響

2.2.2 pH對菌生長的影響

pH會使蛋白質和核酸等生物大分子所帶電荷及其細胞膜電荷發生變化，對細菌吸收運輸柴油具有較大影響，從而影響菌株的生長.2種菌株在最適溫度下利用不同pH(5.0，6.0，7.0，8.0和9.0)的柴油無機培養基(柴油量為1%)培養，結果表明，EGY和GY生長最適的pH分別為8.0和7.0，EGY生長偏愛堿性環境，強酸環境不利其生長(見圖4).

圖4 pH對EGY和GY生長的影響

2.2.3 柴油含量對菌株生長的影響

降油菌在含油量過少的環境中不能獲取足夠的碳源而影響生長繁殖，而過高也會影響其對氧氣和營養物質的利用，影響其正常生長.探究不同柴油濃度下(0.5%，1.0%，1.5%，2.0%和2.5%)各菌株生長情況.結果表明,2株菌最適生長含油量為1.5%.在柴油濃度小于1.5%時，隨著柴油濃度的增加,菌生長能力增加明顯；而大于1.5%時，生長能力有所下降(見圖5).

圖5 柴油濃度對EGY和GY生長的影響

2.2.4 NaCl濃度對菌株生長的影響

無機鹽是細胞、酶的重要組成部分，也為細胞提供合適的滲透壓.高濃度無機鹽會增加細胞的滲透壓，抑制微生物各種代謝酶的活性，降低其降解污染物能力.2種菌株分別利用不同鹽度(1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 g/L)的柴油無機培養基，并在各自的最適溫度、pH、含油量條件下培養.結果表明，EGY和GY分別在鹽濃度為1.5，2.0 g/L時生長量達到最大(見圖6).

圖6 NaCl濃度對EGY和GY生長的影響

2.3 菌株降解油污能力分析

通過分析EGY和GY菌株的生長溫度、pH、鹽濃度等，筆者發現，EGY的最優生長條件最接近于加油站等附近的土壤環境.將此菌株接種至不同柴油濃度的無機培養基中培養后測定降解率，結果表明,在較低柴油濃度下(0.5%),柴油降解率高達40.2%;但當柴油濃度為1.5%，2.5%時，降解率穩定在25%左右，無顯著差異.在0.5%，1.5%濃度下，EGY對芳香烴的降解率大于40%，無顯著差異;但當濃度為2.5%時，芳香烴降解率顯著下降(見圖7).為分析EGY對土壤的修復效果，將EGY接種至含1.0%柴油的滅菌土壤中，并分析土壤鹽度對降解效果的影響.結果表明,未接EGY的土壤中柴油逐漸被自然降解，10 d時柴油降解率為15.3%；而在最適鹽度和未調節鹽度下接入EGY后,初始降解速度較快，6 d后降解緩慢，10 d后降解率分別為72.1%，57.8%(見圖7).

(A)無機鹽培養基中

(B)1.0%柴油土壤中

3 討論與分析

科學家已從柴油污染樣品中篩選了芽孢桿菌、假單胞菌、不動桿菌等[14-16]多種柴油降解菌，但多數降解菌只應用在海洋、油田等大型區域，在加油站或修車廠等附近區域還未應用于實際.研究從加油站等周圍的土壤樣品中篩選到優異柴油降解菌EGY和GY，并優化其柴油降解條件，將進一步促進微生物修復在柴油污染修復中的應用.在EGY所屬的不動桿菌屬中，報道的柴油降解菌較多，如Acinetobacterbeijerinckii[17]，Acinetobactercalcoaceticus[18]及AcinetobacterjuniiB6[19]等，暗示EGY可以作為優異的柴油降解菌.GY所屬的鞘脂菌屬是多環芳香烴污染土壤中的主要菌屬[20]，也能以柴油為唯一碳源生長.有研究報道,與GY親源關系較近的Sphingobiumlactosutens和Sphingobiumchungbukense也能降解環芳香烴[21-22]，因此,后續實驗將分析GY降解芳香烴的能力.

在實際應用過程中，適宜的生長條件能有效提高降解菌降解柴油的能力，如營養鹽、pH、溫度等[23].對于柴油降解菌而言，溫度會影響生物表面活性劑的穩定性及細菌對柴油的攝取能力.一些篩選的柴油降解菌的最適降解溫度已被確定，如假單胞菌F4為37 ℃[14]，鮑氏不動桿菌為35 ℃[24].EGY和GY最適溫度分別為25 ℃和35 ℃，與上述報道降解菌最適溫度接近，可應用于加油站、修車廠等附近的土壤修復.pH可顯著影響一些表面活性劑的形態與表面張力，從而影響菌株的降解能力[25].因此，GY和EGY在柴油培養基中的pH生長特性可能與其分泌的表面活性劑有關.GY和同屬的Sphingobiumsp. FB3[26]及一些降解菌(如假單胞菌[14]、芽孢桿菌[16]等)的最適pH都為中性，而EGY的最適pH為8，適合應用在堿性環境中.EGY和GY最適鹽度分別為1.5 g/L和2.0 g/L，顯著低于海洋環境中典型的鹽度(3.0%～3.5%)，因此,這些菌株不適合應用在海灘或潮間地帶.在柴油無機培養基中，2株菌的最適生長含油量為1.5%，而PALANISAMY等[15]篩選的鮑氏不動桿菌最適柴油量為4.0%.2株菌不適合在高濃度柴油下生長，可能是由于過量柴油的加入導致溶液中含氧量低及芳香烴含量增加所致.EGY培養后出現了乳化現象，表明EGY可能通過產生生物表面活性劑降解柴油.許多文獻也報道了不動桿菌能通過分泌鼠李糖脂[6]、脂肽類[19]及生物分散劑[18]等，以降低油水表面張力、增加烴類溶解性.此外，Tao等[4]研究發現其篩選的瓊氏不動桿菌能夠產生生物表面活性劑，但在培養物中未發現糖脂類和肽脂類，說明該類活性劑不屬于這2類.因此，為明確EGY降解柴油的機制，后續實驗需提取、鑒定及明確該類生物表面活性劑.

為分析EGY的柴油降解能力及實際應用情況，筆者分析了不同柴油濃度對其降解率的影響，以及EGY是否適合于降解土壤中柴油.利用不同柴油濃度培養EGY時，發現低柴油濃度條件下細菌為獲取足夠的碳源，導致其具有較高的降解率(40.2%)，但其降解量遠小于高柴油濃度條件下的降解量，這與生長最適初始柴油濃度為1.5%相符.2.5%初始濃度時，柴油降解量最大但細菌生長情況較差，可能是由于高濃度柴油下，EGY優先選擇降解脂肪烴，導致芳香烴的積累影響了細菌生長[27].EGY接入污染土壤10 d后，通過調節土壤鹽度，其降解率(72.1%)遠高于自然降解率(15.3%)，提高了污染土壤的修復速度.在自然降解中，由于土壤細菌作用及柴油揮發等原因，每天有1.5%的柴油被降解.實驗組中，在前6 d具有較大的降解速率可能是由于EGY能夠選擇并快速降解線性或短鏈碳氫化合物，而之后需利用一些難以利用的化合物(如芳香族碳氫化合物)并產生具有毒性的中間產物等，限制了降解速率[2].

本研究雖然初步明確了EGY的柴油降解條件和降解性能，但柴油降解菌的降解效率也受到其他多種不同因素的影響，如柴油的性質、不同微生物之間的相互作用、土壤種類等.在后續的研究中將著眼于EGY降解柴油的內在機制，以及其可能分泌的表面活性劑等，進一步優化其降解能力等方面；還可探究EGY與其他微生物優勢菌群的相互作用及復配，為將來應用于實際提供理論依據.此外，在實驗室控制條件下探討降解修復性能無法準確、長久地反映實際應用情況[28]，后續將利用真實的污染土壤地塊，分析EGY的柴油降解能力，為將來規模化實際應用奠定基礎.