線粒體在細胞衰老中的作用

王玉全，李程程，孟愛民，樊飛躍

(中國醫學科學院醫學實驗動物研究所 北京協和醫學院比較醫學中心 國家衛生健康委員會人類疾病比較醫學重點實驗室北京市人類重大疾病實驗動物模型工程技術研究中心，北京 100021)

細胞衰老是指細胞在執行生命活動過程中增殖分化能力和生理功能逐漸發生衰退的過程。研究發現眾多疾病與細胞衰老有關，如腫瘤、特發性肺纖維化、高血壓、帕金森病、糖尿病等[1-4]。因此，細胞衰老機制的研究對于相關疾病致病機制的認識、治療方法的發現、治療藥物的研發具有重要意義。近年來對于細胞衰老分子機制的研究主要包括氧化自由基學說、DNA損傷積累和端粒縮短等。線粒體作為細胞“能量工廠”，其質量、活性改變與細胞衰老密切相關。線粒體損傷引發的線粒體功能障礙導致活性氧類(reactive oxygen species，ROS)代謝紊亂，過多的ROS具有細胞毒性作用，造成脂質、蛋白質、DNA損傷，激活DNA損傷應答，導致細胞衰老。有研究表明，提高衰老細胞中線粒體自噬水平可以清除損傷的線粒體，降低細胞內ROS，緩解細胞衰老表型[5]。近年來研究發現衰老與干細胞功能的下降密切相關，而線粒體自噬可以有效清除干細胞中功能缺陷的線粒體，維持干細胞功能[6]。由此，線粒體改變可能影響細胞衰老過程，線粒體損傷修復可能是應對細胞衰老有效的靶向策略。現就衰老細胞中線粒體的改變，線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)、ROS、線粒體自噬、線粒體介導的干細胞功能和炎癥調節在細胞衰老中的作用進行綜述。

1 衰老細胞中線粒體形態、數量改變

正常細胞中線粒體是一個雙層膜的囊狀小體，由外膜、膜間隙、內膜、基質組成。電鏡下觀察外膜光滑連續，結構簡單；內膜高度折疊成嵴；通常情況下呈短棒狀或圓球狀，大小0.5～1.0 μm。研究發現，與正常細胞相比，衰老的卵巢細胞中線粒體的結構形態、數量發生了很大變化，主要表現為線粒體體積腫脹增大，線粒體數目減少或增加，線粒體內膜損傷或嵴縮短，線粒體變性導致空泡等[7]。臍靜脈內皮細胞的傳代培養中發現衰老細胞出現線粒體減少，線粒體腫脹、積水樣變[8]。在阿奇霉素所致的大鼠心力衰竭模型中也發現了心肌細胞線粒體結構的損傷改變[9]。對人和嚙齒類動物卵巢的研究發現，卵母細胞線粒體數量隨年齡的增長而減少，線粒體基質密度下降，線粒體嵴減少，甚至出現空泡和破裂現象[10]。這表明線粒體形態、結構、數量的變化與細胞衰老密切相關。線蟲衰老研究發現神經、腸、肌肉組織細胞中線粒體數量逐漸累積，這種線粒體數量穩態改變受到線粒體生成和線粒體自噬相關基因的協同調節，穩態失衡導致功能障礙線粒體的累積，造成細胞功能衰退[11]。但對不同年齡人的骨骼肌細胞線粒體分離研究中并未發現線粒體數目的差異[12]。小鼠和果蠅研究中發現[13],老年果蠅線粒體內膜出現顯著的形態改變及功能改變，這種改變是由衰老相關氧化磷酸化系統損傷及線粒體ROS產生導致；然而在小鼠心臟細胞線粒體中無明顯的鼠齡改變，1/4肝臟細胞線粒體出現嚴重衰老相關表型但整體氧化磷酸化水平沒有降低，具有明顯的組織特異性。隨著年齡增長或在衰老的器官組織細胞中會發生線粒體形態、結構、數量的改變，但它們之間確切的因果關系及分子機制還需要進一步研究。

2 mtDNA突變引發細胞衰老

人mtDNA是由16 569個堿基組成的環狀DNA分子，沒有內含子，D環是唯一的非編碼區，調控mtDNA的復制轉錄。mtDNA主要編碼電子傳遞鏈復合體蛋白及其相關組分，與線粒體的功能密切相關。mtDNA缺乏組蛋白和內含子，極易發生突變。與衰老有關的mtDNA突變主要有點突變、缺失和重排，mtDNA的點突變和缺失發生頻率最高。研究證明mtDNA損傷突變與骨骼肌、心、肝、腦、皮膚等器官的衰老密切相關，衰老的骨骼肌，心肌細胞中檢測到mtDNA4977缺失，mtDNA4977突變會干擾細胞中呼吸相關蛋白的合成，導致線粒體功能障礙，導致細胞功能受損而發生衰老[14-15]。同時，心肌細胞中mtDNA突變的累積會導致電子傳遞鏈功能組分的合成障礙，從而導致電子傳遞鏈功能下降，加劇心肌細胞衰老[16]。mtDNA聚合酶缺陷小鼠模型檢測到mtDNA突變累積，表現壽命縮短和過早衰老[17]；加速衰老小鼠易發8(senescence-accelarated mouse prone 8，SAMP8)模型表現與年齡有關的神經退行性變，學習和記憶能力受損，這與其大腦細胞中mtDNA修復能力改變和mtDNA損傷水平有關[18]。綜上，mtDNA突變一方面會造成線粒體呼吸相關功能組分的合成障礙和缺失，線粒體呼吸能力的下降，從而引發細胞衰老；另一方面，mtDNA突變可能會造成mtDNA復制、修復障礙，突變mtDNA在線粒體內的積累，加重線粒體損傷，加劇細胞衰老。

3 線粒體ROS參與細胞衰老調節

線粒體是細胞的“能量工廠”和自由基代謝中心，線粒體的主要功能是將高能物質經過三羧酸循環產生的煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸/煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、黃素腺嘌呤二核苷磷酸/黃素腺嘌呤二核苷酸通過電子傳遞鏈轉化為腺苷三磷酸，為機體細胞供能，調節能量代謝。線粒體作為機體細胞最重要的供能“機器”，線粒體的呼吸能力直接關系心肌和骨骼肌的功能，因此線粒體呼吸能力下降會導致心肌和骨骼肌功能障礙，誘發心肌、骨骼肌細胞衰老[19]。同時，線粒體電子傳遞鏈的完整對于維持線粒體正常呼吸功能至關重要，許多動物模型中發現線粒體電子傳遞鏈復合體的生物合成直接影響細胞衰老[20-21]。目前研究認為，線粒體損傷及功能障礙引發細胞衰老主要與ROS代謝有關。線粒體呼吸鏈中電子傳遞是ROS的主要發生器，ROS對于細胞生存、激發損傷應答、細胞增殖、能量代謝具有重要作用[22]。然而，高水平的ROS對細胞具有毒性，造成細胞脂質、蛋白質、DNA損傷[23]。傳統的線粒體自由基損傷理論認為ROS作為線粒體能量代謝的副產物在影響線粒體功能導致細胞衰老上有重要作用。1950年，Harmon首次提出ROS直接調控細胞衰老過程，同時，Linnane和Fleming認為ROS的產生增多導致mtDNA突變，引發細胞衰老[24]。由此可見，線粒體ROS是細胞衰老的重要誘導因素。有研究證實，27-羥基膽固醇通過促進細胞內ROS積累并激活白細胞介素-6/信號轉導及轉錄激活因子3信號通路誘導神經細胞衰老，ROS產生阻斷可以緩解27-羥基膽固醇誘導的神經細胞衰老[25]。線粒體ROS穩態的破壞也是誘導細胞衰老的關鍵因素。在間充質干細胞中，阻止線粒體ROS的積累可以抑制間充質干細胞衰老，酪氨酸蛋白激酶B2受體可以通過調節線粒體乙酰化酶3的表達維持線粒體ROS的穩態，減少間充質干細胞的衰老[26]。研究發現，人和小鼠成纖維細胞中DNA損傷應答能激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助活化因子1β調節的線粒體生物合成，引起ROS水平增高，加劇細胞衰老[27]。在羥基脲誘導的小鼠成纖維細胞衰老模型中，可以通過調節線粒體乙酰化酶3的表達調節叉頭框轉錄因子O亞族3和超氧化物歧化酶的表達來減少ROS的產生，延遲衰老[28]。因此，線粒體內過多ROS的清除及其穩態的維持可以有效抑制細胞衰老。

4 線粒體自噬減緩細胞衰老

線粒體自噬是一種細胞防御代謝過程，通過自噬途徑選擇性清除衰老、損傷的線粒體，以促進線粒體更新，維持線粒體功能。這一概念由Lemasters[29]首次提出。細胞衰老中線粒體自噬調節與一般自噬稍有不同，一般的自噬活性根據衰老模型而升高或降低，而在衰老細胞中，線粒體自噬活性在體外和體內均降低[30-31]。在磷酸酶及張力蛋白同源物誘導的蛋白激酶1(PTEN induced putative protein kinase 1，PINK1)-PRKN(Parkin RBR E3 ubiquitin protein ligase)通路介導的線粒體自噬中，Parkin激酶能泛素化線粒體外膜蛋白，這些蛋白一旦被泛素化便可被線粒體自噬受體蛋白視神經蛋白(Optineurin)、核點蛋白52和Tax1結合蛋白1識別，從而激發自噬體的組裝，清除損傷線粒體[32]。細胞衰老過程細胞質中積累p53與Parkin相互作用，阻止其轉運到功能失調的線粒體，從而抑制線粒體自噬，維持細胞衰老[31]。這進一步提示線粒體自噬在細胞衰老過程中的重要作用。人支氣管上皮細胞中PINK1和Parkin的敲除會加速其衰老，同時伴隨損傷線粒體累積和ROS產生增加[33]。暴露于香煙的PRKN敲除小鼠中，呼吸道上皮細胞表現出線粒體損傷積累和氧化修飾增加，并伴有細胞衰老的加速，PRKN過表達則可以誘導線粒體自噬，減弱線粒體ROS的產生，減緩細胞衰老[34]。這表明線粒體自噬受損會導致損傷線粒體累積，細胞ROS水平升高，加速細胞衰老。也有研究發現衰老細胞中，PINK1-Parkin介導的線粒體自噬激活能夠清除損傷線粒體，消除通常情況下表達的衰老相關表型，進一步揭示線粒體自噬在清除受損線粒體，減緩細胞衰老中的重要作用[35]。線蟲衰老研究發現細胞應激下SKN-1轉錄因子的激活可以通過調節DCT-1的表達調節線粒體自噬和線粒體生物合成，從而清除損傷線粒體，維持線粒體穩態。細胞衰老過程中，這種穩態的失衡會導致損傷線粒體的過度增殖，細胞功能衰退[36]。在糖尿病腎病中，腎小管上皮細胞的早衰主要是由受損線粒體的積累導致的，視神經蛋白調節的線粒體自噬可以保護腎小管上皮細胞抵抗高糖誘導的衰老[37]。由此可見，線粒體自噬能夠清除受損線粒體，減緩細胞衰老。

5 線粒體與干細胞衰老

干細胞衰老通常伴隨著組織代謝和再生潛能的下降，成年人干細胞功能衰退與線粒體密切相關[38]。在所有組織中，衰老相關線粒體功能的衰退效應對成體干細胞群功能具有重要影響。造血干細胞研究發現，靜止期造血干細胞主要通過糖酵解代謝供能來維持較低的氧環境，以減少線粒體ROS產生的毒性作用[39]。同時，有研究表明ROS作為信號分子，一定水平的ROS對造血干細胞增殖分化有調節作用[40]，水平過高對造血干細胞功能具有損傷作用[41-42]。mtDNA突變小鼠研究揭示了線粒體與干細胞功能之間的聯系，mtDNA突變鼠存在干細胞缺陷及功能損傷，給予抗氧化劑治療，干細胞缺陷及功能損傷得到改善[43-44]。這表明，線粒體損傷直接干擾、損傷小鼠干細胞功能，而這種干擾損傷作用很有可能是由線粒體異常引發的ROS代謝異常導致的。線粒體幫助干細胞維持功能的另一種機制主要是通過調節代謝物乙酰輔酶A、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、腺嘌呤核糖核苷酸、S-腺苷甲硫氨酸/S-腺苷同型半胱氨酸的比率來調節干細胞的自我更新和穩態[45-46]，如老年小鼠給予煙酰胺核苷治療可以恢復肌肉干細胞活力，煙酰胺核苷也可以阻止肌營養不良小鼠肌肉干細胞衰老，這主要是由于氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)水平的提高誘導線粒體非折疊蛋白效應(UPRmt)和抗增殖蛋白合成的激活，提高了線粒體穩態調節功能[47]。同時，干細胞可以通過一定的機制清除功能缺陷的線粒體，大腦研究發現大腦神經干細胞富集區域線粒體自噬率升高[48]，PINK1基因缺陷小鼠實驗也證實線粒體自噬對線粒體質量的控制是干細胞命運至關重要的決定因素[49]，人乳腺干細胞分裂研究發現干細胞樣細胞可以通過不對稱分裂來隔離年輕和衰老的線粒體，以保持干細胞活性[50]。上述研究為了解線粒體對于干細胞全能性的維持及組織分化修復上提供了新的觀點，也為細胞衰老及衰老相關疾病的研究提供了新的指導方向。

6 線粒體調節的炎癥反應與衰老

衰老細胞會產生一系列復雜的分泌因子，包括基質金屬蛋白酶、生長因子和促炎癥細胞因子，統稱為衰老相關分泌表型，衰老相關分泌表型可以加重衰老細胞的促衰老效應。衰老相關分泌表型的形成與線粒體密切相關，線粒體損傷調節的機體免疫應答的激活在一定程度上促進炎癥細胞因子的分泌。一方面mtDNA類似于細菌DNA，能夠通過Toll樣受體9、Nod樣受體蛋白3炎癥小體[51]、受體蛋白干擾素基因刺激物快速激活抗菌免疫應答[52]。同時，損傷的線粒體可以釋放甲酰多肽，通過甲酰多肽受體1激起免疫應答[53]。另一方面，采用化學藥物抑制線蟲線粒體功能，發現短暫的線粒體功能障礙也可以作為病原攻擊激活免疫應答[54]，表明線粒體功能異常同樣可以激發炎癥反應，而這種激發作用很有可能是由于線粒體ROS代謝異常導致的。在對阿爾茨海默病風險因素——環境毒素(百草枯)暴露對哺乳動物認知功能障礙的作用研究中發現線粒體ROS清除可以抑制Nod樣受體蛋白3炎癥應答的激活，減少大腦炎癥反應，緩解認知功能障礙[55]。在SAMP8小鼠神經退行性改變早發的研究中也發現線粒體ROS在炎癥激活中的作用，SAMP8小鼠具有較多的線粒體ROS產生，較低的mtDNA修復能力，高水平的氧化應激誘導炎癥反應，促進炎癥細胞因子釋放，同時，mtDNA損傷的增加加劇線粒體功能障礙及細胞功能障礙，最終協同導致SAMP8小鼠神經退行性改變的早發[18]。盡管如此，在細胞衰老過程中，線粒體損傷既可能是炎癥的激發劑，也可能是炎癥反應的結果，它們均可在一定程度上促進衰老的發生、發展。

7 展 望

線粒體在受到輻射等氧化刺激時會發生mtDNA突變。mtDNA突變一方面會造成線粒體內與電子傳遞鏈相關組分的合成障礙和缺失，線粒體功能障礙。線粒體功能障礙導致機體組織細胞的能量代謝障礙，ROS代謝失調，引發細胞衰老。另一方面，mtDNA突變會造成mtDNA復制障礙，造成突變mtDNA在線粒體內的積累，突變的累積可以激活DNA損傷應答，造成細胞周期阻滯及ROS生成增加，高水平的ROS則可作為毒性分子進一步損傷線粒體，加劇細胞衰老甚至導致細胞凋亡。同時，線粒體功能損傷，ROS代謝障礙可以影響干細胞功能調節，造成組織再生、修復障礙、炎癥反應的激活。線粒體損傷導致的線粒體蛋白、mtDNA外溢以及線粒體功能受損可以作為損傷相關分子模式激活免疫應答，免疫因子大量表達，進一步損傷機體其他細胞。當然，機體可以通過線粒體自噬等途徑來清除損傷、功能障礙的線粒體，以維持機體代謝穩態，延緩細胞衰老。說明線粒體損傷修復、線粒體功能復原及提高線粒體質量控制將是應對細胞衰老的有效策略。隨著對衰老機制的深入研究，線粒體在細胞衰老中的作用會更加清楚，大范圍的線粒體靶向治療很可能成為對應對衰老的有效策略，在緩解或治愈衰老相關疾病中發揮重要作用。