非編碼RNA對冠心病發(fā)生發(fā)展影響的研究進(jìn)展

李 平，龐 智，朱劍云，孫琛琛，孫康云

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院心血管內(nèi)科 蘇州市消化系疾病與營養(yǎng)研究所，江蘇 蘇州 215008)

冠心病是冠狀動脈血管發(fā)生動脈粥樣硬化病變而引起血管腔狹窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或壞死而導(dǎo)致的心臟病，常常被稱為“冠心病”。動脈粥樣硬化是心血管疾病的主要形式，是炎性斑塊和包含多種復(fù)雜相互作用的不同類型的細(xì)胞和修飾脂蛋白沉積在動脈壁內(nèi)的慢性炎癥反應(yīng)[1]。近年來我國居民冠心病及急性心肌梗死死亡率呈快速上升趨勢，農(nóng)村上升更為明顯。主要原因是高血壓、高膽固醇血癥等主要危險因素持續(xù)升高，知曉率、治療率及控制率雖有升高，但仍處于較低水平[2]。男性、肥胖、吸煙、糖尿病、高血壓、高血脂以及相關(guān)遺傳因素等危險因素與冠心病的發(fā)生相關(guān)。目前針對冠心病的診斷方法主要依靠臨床醫(yī)師的經(jīng)驗、物理診斷和臨床生化指標(biāo)實驗診斷。早發(fā)冠心病易感基因和特征性炎癥介質(zhì)的研究成果使冠心病易感人群的大規(guī)模篩選具有了可能性，也有利于冠心病預(yù)防的關(guān)口前移，這是近年國內(nèi)外研究的熱點之一。

全球性的轉(zhuǎn)錄分析發(fā)現(xiàn)66%的基因組被轉(zhuǎn)錄，其中80%是呈現(xiàn)活性轉(zhuǎn)錄的生物化學(xué)標(biāo)記，然而不到2%的能夠編碼蛋白質(zhì)[3]。絕大多數(shù)非編碼的調(diào)控元件被轉(zhuǎn)錄成非編碼RNAs(non-coding RNAs,ncRNAs)[4]。近年來，ncRNAs作為冠心病早期診斷血液標(biāo)志物的研究已成為當(dāng)前的研究熱點，現(xiàn)從ncRNA入手，對近幾年的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 微RNA與冠心病的關(guān)系

微RNA(microRNA，miRNA)是一種小型(19～25 nt)單鏈ncRNA，轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)，在細(xì)胞代謝、分化、增殖和凋亡等多種生物過程中起著至關(guān)重要的作用[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA具有組織特異性，并且與心血管系統(tǒng)生理及病理變化相關(guān)[7]。此外，由于miRNA片段較小，在體液中能夠穩(wěn)定檢測到，并且能夠耐受內(nèi)源性RNA酶的降解作用[8]。這些優(yōu)勢使得miRNA能夠成為心血管疾病早期篩查比較理想的生物標(biāo)志物之一。

近幾年，關(guān)于miRNA的研究非常多，在冠心病患者中發(fā)現(xiàn)了許多與健康對照組差異表達(dá)的miRNA。研究發(fā)現(xiàn)，這些與冠心病疾病相關(guān)的miRNA，通過影響脂質(zhì)代謝，血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、凋亡，炎癥反應(yīng)以及端粒長度來影響冠心病的發(fā)生發(fā)展。

1.1脂質(zhì)代謝相關(guān)miRNA與冠心病 miR-370在脂類代謝中起關(guān)鍵作用，能夠下調(diào)肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1α基因的表達(dá)從而控制脂肪酸氧化作用[9]。取臨床95例冠心病患者和50例健康組血漿，使用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)miR-370在冠心病患者中較正常人表達(dá)量明顯升高[10]。miR-24與體內(nèi)油脂的積累以及高三酰甘油血癥密切相關(guān)，在早期和晚期動脈粥樣硬化斑塊中被公認(rèn)為特異性miRNA[11]。miR-33a被認(rèn)為是維持細(xì)胞膽固醇穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵后轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因，與脂肪酸氧化的重要基因如膽固醇運輸基因ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白A1、腺苷三磷酸結(jié)合盒亞家族G1抗體和尼曼-皮克病C1型相關(guān)聯(lián)[12]。miR-103a參與細(xì)胞輔酶A和脂質(zhì)代謝途徑[13]。miR-122調(diào)節(jié)與脂質(zhì)合成及氧化相關(guān)的基因包括固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白、微粒體三酰甘油轉(zhuǎn)移蛋白、Krupple 樣因子6和陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白基因，沉默miR-122會導(dǎo)致血漿中總膽固醇和三酰甘油水平降低。運用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法檢測161例臨床冠心病患者和150例健康組單核粒細(xì)胞中miRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miR-24、miR-33a、miR-103a和miR-122在冠心病患者中表達(dá)量高于健康組[14]。50例家族性高膽固醇血癥患者血漿中miR-130a-3p表達(dá)水平較24例健康組下調(diào)，另外，miR-130a-3p與冠狀動脈粥樣硬化程度呈負(fù)相關(guān)[15]。

1.2細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)miRNA與冠心病 miR-206在冠心病患者血漿和患病的內(nèi)皮祖細(xì)胞中表達(dá)量均較高，miR-206能夠明顯抑制冠心病患者內(nèi)皮祖細(xì)胞的生存和侵入能力，增加內(nèi)皮祖細(xì)胞的凋亡。并且發(fā)現(xiàn)miR-206能夠抑制血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)[16]。同時，miR-126能夠通過上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)來調(diào)節(jié)血管的完整性和血管發(fā)生，并且在小鼠體內(nèi)進(jìn)行miR-126敲除會導(dǎo)致血管的滲漏[17]。在82例冠心病患者血漿中miR-126表達(dá)量明顯較42例健康組低[18]。研究發(fā)現(xiàn)，在冠心病患者的血清和血管平滑肌細(xì)胞中，miR-574-5p的表達(dá)水平較高。另外，miR-574-5p通過抑制ZDHHC14(zinc finger DHHC-type containing 14)基因的表達(dá)來促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡[19]。miR-362-3p抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，阻礙了細(xì)胞G1/S周期的轉(zhuǎn)變。生物信息學(xué)分析表明，miR-362-3p與血栓形成的一種分離蛋白和金屬蛋白酶凝血酶敏感素1型基序的解聚素樣金屬蛋白酶結(jié)合，能夠抑制其mRNA和蛋白的表達(dá)，在110例冠心病患者血漿中miR-362-3p表達(dá)量較84例健康對照明顯下調(diào)[20]。與正常的冠狀動脈組織相比，miR-448在冠狀動脈粥樣斑塊的血管平滑肌中表達(dá)上調(diào)，肌細(xì)胞增強因子2C過表達(dá)降低了miR-448誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移[21]。冠心病患者內(nèi)皮祖細(xì)胞功能失調(diào)，是由循環(huán)miR-146a和miR-146b在心血管中的負(fù)反饋循環(huán)引起的。研究表明，miR-146a-5p和miR-146b-5p與許多血管生成相關(guān)的基因關(guān)聯(lián)，這些基因在冠心病患者內(nèi)皮祖細(xì)胞中下調(diào)表達(dá)[22]。研究結(jié)果顯示，在冠心病患者中miR-939表達(dá)下調(diào)。miR-939通過靶向γ聯(lián)蛋白來抑制血管生成，破壞了血管的完整性。在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)中過表達(dá)miR-939能夠明顯抑制細(xì)胞增殖、黏附和血管生成，但是會增加細(xì)胞的遷移[23]。miR-133a的轉(zhuǎn)錄濃度梯度增加與急性冠狀動脈綜合征患者的病死率增高有關(guān)，而且增加了穩(wěn)定的冠心病患者支架內(nèi)再狹窄新的血管化發(fā)生率[24-25]。miR-499在216例冠心病患者中較90例健康組中上調(diào)表達(dá)，下調(diào)表達(dá)miR-499能夠通過抑制腫瘤壞死因子-α激活核因子κB信號通路來保護(hù)冠心病內(nèi)皮細(xì)胞免受炎癥的損害[26]。miR-20a在冠心病患者中較健康組下調(diào)表達(dá)，能夠特異性結(jié)合人第10號染色體缺失的磷酸酶的3′非翻譯區(qū)，通過激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號通路來增加血管內(nèi)皮細(xì)胞的成活和增殖[27]。

1.3炎癥反應(yīng)相關(guān)miRNA與冠心病 與內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)的miR-126也能夠通過介導(dǎo)細(xì)胞間黏附因子1的白細(xì)胞浸潤來抑制血管的炎癥反應(yīng)[28]。在冠心病患者中miR-22在外周血單核細(xì)胞中下調(diào)表達(dá)，miR-22可以通過負(fù)調(diào)控單核細(xì)胞趨化蛋白1靶向參與炎癥反應(yīng)從而導(dǎo)致冠心病的發(fā)生[29]。血清中miR-21水平與內(nèi)脂素水平呈正相關(guān)，急性冠狀動脈綜合征患者血清miR-21水平明顯高于穩(wěn)定冠心病患者，血清miR-21和內(nèi)脂素的增加可能促進(jìn)急性冠狀動脈綜合征的炎癥反應(yīng)，也可能來自急性冠狀動脈綜合征的炎癥反應(yīng)。此外，miR-21和內(nèi)脂素在斑塊不穩(wěn)定性和炎癥中的潛在作用還值得進(jìn)一步研究[30]。在動脈粥樣硬化的炎癥反應(yīng)中，miR-10a與血清白細(xì)胞介素-10水平呈正相關(guān)，與健康組相比，miR-10a在冠心病患者組表達(dá)下調(diào)[31]。

1.4端粒相關(guān)miRNA與冠心病 端粒重復(fù)結(jié)合因子在端粒的維持中起重要作用，miR-23a可以直接抑制端粒重復(fù)結(jié)合因子的表達(dá)，從而誘導(dǎo)端粒縮短和細(xì)胞衰老。高水平的miR-23a通過下調(diào)端粒重復(fù)結(jié)合因子的表達(dá)，誘導(dǎo)端粒縮短，與冠狀動脈疾病患者的臨床預(yù)后不良有關(guān)[32]。

2 長鏈非編碼RNA與冠心病的關(guān)系

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長度>200 bp的ncRNA，沒有任何潛在的編碼蛋白質(zhì)的能力[33]。lncRNA因其細(xì)胞和組織的特異性可以作為癌癥的生物標(biāo)志物和治療靶點，并且可以在凋亡或壞死腫瘤細(xì)胞分泌或釋放的血液、血漿和尿液細(xì)胞中檢測到[34]。越來越多的研究表明，lncRNA在很多癌癥中非正常表達(dá)，在細(xì)胞增殖、凋亡或侵襲都有一定的生物學(xué)功能[35-36]。根據(jù)最近的蛋白質(zhì)編碼基因，lncRNA可以分為5個不同的類型[37]：①正義鏈lncRNAs，與相同鏈的另一個蛋白質(zhì)編碼基因的一個或多個外顯子相重疊；②反義型lncRNAs，與相反鏈的另一個蛋白質(zhì)編碼基因的一個或多個外顯子相重疊；③內(nèi)含子區(qū)lncRNAs，來源于次級轉(zhuǎn)錄物的內(nèi)含子區(qū)域；④雙向lncRNAs，轉(zhuǎn)錄起始位點與相反鏈上編碼蛋白質(zhì)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點非常接近，但轉(zhuǎn)錄方向相反；⑤基因間型lncRNAs，產(chǎn)生于兩個基因之間的區(qū)域。

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)lncRNA與冠心病的發(fā)生、發(fā)展也有很大的聯(lián)系。lncRNA在誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，血管平滑肌細(xì)胞增殖、凋亡，以及脂肪代謝相關(guān)方面都發(fā)揮重要作用。

2.1細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)lncRNA與冠心病 在冠心病中l(wèi)incRNA-p21是一個重要的細(xì)胞增殖與凋亡的調(diào)節(jié)基因，在血管平滑肌細(xì)胞中l(wèi)incRNA-p21能夠抑制細(xì)胞增殖，引起細(xì)胞凋亡[38]。并且lincRNA-p21的G-A-A-G單倍型與冠心病患病風(fēng)險降低相關(guān)[39]。在外周血單核細(xì)胞中通過微芯片以及實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法篩選出3個較好的冠心病lncRNA標(biāo)志物(CoroMarker、BAT5和IL21R-AS1)，其中CoroMarker在冠心病較其他的心血管疾病中差異表達(dá)，特異性和敏感性更好。并且實驗證明這個CoroMarker基因能夠正向調(diào)控泡沫細(xì)胞的形成和動脈硬化，抑制細(xì)胞凋亡、炎癥以及相關(guān)免疫反應(yīng)[40]。H19是一個轉(zhuǎn)錄lncRNA的印跡基因并且在出生后表達(dá)下調(diào)。研究首次證明H19的多態(tài)性與中國人冠心病的風(fēng)險和嚴(yán)重程度有關(guān)[41]。同時，也有研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)H19基因的表達(dá)能夠促進(jìn)鼠心肌細(xì)胞P19CL6的增殖和抑制細(xì)胞凋亡，而這個過程是在心臟分化晚期通過負(fù)調(diào)控miR-19b來完成的[42]。冠心病患者血漿H19和預(yù)測心臟重構(gòu)的基因間lncRNA、LIPCAR水平顯著升高[43]。在508例冠心病患者和562名年齡、性別和種族匹配的健康組中發(fā)現(xiàn)，MALAT1中的rs619586AG/GG基因型可預(yù)防冠心病的發(fā)生。下調(diào)MALAT1可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞的增殖，減少心肌細(xì)胞凋亡，改善左心室功能，與冠心病等諸多病理過程密切相關(guān)[44]。MEG3表達(dá)水平在冠心病患者中較健康組下調(diào)。過表達(dá)MEG3能夠抑制miR-21的表達(dá)，從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和減少Ⅰ型膠原蛋白，Ⅴ型膠原和蛋白聚糖的表達(dá)[45]。

2.2其他與冠心病發(fā)生發(fā)展相關(guān)的lncRNA Fendrr被認(rèn)為在胚胎期的心臟系統(tǒng)發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并且Fendrr具有組織特異性，是心臟和身體壁發(fā)育的調(diào)節(jié)劑[46]。研究發(fā)現(xiàn)在冠狀動脈斑塊中，F(xiàn)ENDRR的表達(dá)明顯下調(diào)[47]。Bvht是一個與鼠心臟相關(guān)的lncRNA，是激活多功能心血管前體細(xì)胞主調(diào)控器MesP1上游核心心血管基因網(wǎng)絡(luò)和功能的必要條件[48]。在冠心病患者中，LncPPARδ的表達(dá)量較正常組增加了2.2倍。下調(diào)LncPPARδ的表達(dá)會降低過氧化物酶活化受體δ,脂肪分化相關(guān)蛋白和血管生成素4的表達(dá)[49]。ANRIL的EU741058轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平可能與冠心病的發(fā)展有關(guān)[50]。并且從來自6個獨立研究的12 005名受試者中發(fā)現(xiàn)，ANRIL等位基因rs4977574與冠心病危險之間存在顯著相關(guān)性[51]。H19、MIAT、ANRIL、lincRNA-p21、AC100865.1、OTTHUMT00000387022、NONHSAT112178、Novlnc6、MALAT1、LIPCAR和SRA被認(rèn)為是冠心病的新型調(diào)節(jié)基因或生物標(biāo)志物，參與了冠心病病理的起始和進(jìn)展[52]。

3 環(huán)狀RNA與冠心病的關(guān)系

環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)是一種新型的ncRNA，它形成了一個共價閉合的環(huán)狀結(jié)構(gòu)[53-54]。在整個物種中，大部分的環(huán)是高度保守的，并且經(jīng)常顯示出組織或表達(dá)特異性，在一些心血管疾病和癌癥中通常能檢測到異常表達(dá)的circRNA[55]。circRNA大多數(shù)定位于細(xì)胞質(zhì)中，少數(shù)定位于細(xì)胞核內(nèi)。并且大多數(shù)由外顯子形成，少數(shù)來源于內(nèi)含子或內(nèi)含子片段[56]。其中，很大一部分的環(huán)只產(chǎn)生于一個外顯子或多個外顯子。circRNA有miRNA海綿的功能，可以調(diào)節(jié)基因表達(dá)或直接調(diào)控基因的剪接和轉(zhuǎn)錄，同時其也是細(xì)胞的潛在調(diào)控因子[57]。

3.1細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)circRNA與冠心病 以表達(dá)高糖誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞在體外的circRNAs表達(dá)譜，circRNAs微陣列分析發(fā)現(xiàn)一個上調(diào)表達(dá)的circWDR77。在體外細(xì)胞試驗中，circWDR77沉默顯著抑制平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移。生物信息學(xué)方法發(fā)現(xiàn)miR-124和成纖維細(xì)胞生長因子2是circWDR77的下游目標(biāo)。RNA免疫沉淀和(或)熒光素酶功能驗證實驗表明，circWDR77通過靶向miR-124/成纖維細(xì)胞生長因子2調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，為糖尿病相關(guān)性血管病變提供了新的理論依據(jù)[58]。人體circRNA微陣列分析顯示，在氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的HUVECs中，hsa_circ_0003575得到明顯上調(diào)。結(jié)果表明，hsa_circ_0003575沉默促進(jìn)了HUVECs的增殖和血管生成能力。circRNA微陣列分析揭示了HUVECs的表達(dá)譜，并驗證了hsa_circ_0003575對HUVECs的作用，為動脈粥樣硬化血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷提供了一種治療策略[59]。

3.2其他與冠心病發(fā)生發(fā)展相關(guān)的circRNA 也有研究通過微陣列篩選以及后續(xù)的分析發(fā)現(xiàn)，在冠心病患者中有9種circRNA(hsa_circ_0089378, hsa_circ_0083357, hsa_circ_0082824, hsa_circ_0068942, hsa_circ_0057576, hsa_circ_0054537, hsa_circ_0051172, hsa_circ_0032970, hsa_circ_0006323)能夠通過抑制hsa-miR-130a-3p來促進(jìn)瞬態(tài)受體電位陽離子通道亞家族M成員3的表達(dá)[60]。在137例冠心病患者中hsa_circ_0124644較115名健康組明顯上調(diào)[61]。經(jīng)基因芯片從6名冠心病患者及6例正常對照者中篩選，后經(jīng)實時熒光定量PCR法從20對臨床樣本中驗證發(fā)現(xiàn)外周血hsa-circRNA11783-2與冠狀動脈疾病和2型糖尿病相關(guān)[62]。

目前對于circRNA與冠心病的相關(guān)研究還處于早期研究階段，對深入機制的研究還未成熟，有待更加深入的發(fā)現(xiàn)和探索。

4 小 結(jié)

ncRNA在冠心病發(fā)生發(fā)展及在疾病的診斷和預(yù)測方面具有重要價值，并且成為近幾年國內(nèi)外研究的重點之一。miRNA片段較小，在體液中能夠穩(wěn)定檢測到，并且能夠耐受內(nèi)源性RNA酶的降解作用。lncRNA具有組織特異性，并且參與細(xì)胞內(nèi)多種生物過程的調(diào)控。而最近研究非常廣泛的circRNA，具有高度保守性，并且呈封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不易被核酸外切酶降解，更加穩(wěn)定。具有以上優(yōu)勢，并且與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，使得ncRNA成為新型的生物標(biāo)志物。同時lncRNA、circRNA與miRNA有著非常密切的聯(lián)系，lncRNA可以作為一種競爭性內(nèi)源性RNA與miRNA相互作用，參與靶基因的表達(dá)調(diào)控。對ncRNA全面的總結(jié)也為miRNA、lncRNA、circRNA的通路研究提供更多借鑒意義，隨著研究的不斷進(jìn)展和深入，ncRNA有望真正應(yīng)用于臨床，作為冠心病篩查的生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)。