中性粒細胞外陷阱在炎性疾病中的作用

李彩瑩，梁雨亭，王 丹，塔 娜，趙德超

(哈爾濱醫科大學附屬第一醫院心內科， 哈爾濱 150001)

中性粒細胞是機體抵御病原體入侵的第一道免疫防線，是非特異性免疫的重要組成部分。中性粒細胞是最早到達炎癥部位的免疫細胞，通過吞噬、釋放殺菌顆粒、產生細胞因子等方式消滅并防止病原微生物在體內擴散[1]。除以上方式外，中性粒細胞還存在另一種免疫防御機制——中性粒細胞外陷阱(neutrophil extracellular traps，NETs)。NETs是中性粒細胞活化后釋放的由細胞質和顆粒蛋白組成的胞外網狀結構，是一種新型的抗微生物機制。目前認為NETs是先天性免疫反應的一種形式，不僅可以捕獲、殺滅以及阻止細菌、真菌、病毒、寄生蟲等病原微生物的擴散，還可導致超炎癥病理學[2]，在感染性疾病中具有重要作用。研究發現，炎癥、痛風、類風濕關節炎(rheumatoid arthitis,RA)、系統性紅斑狼瘡、小血管炎等非感染性炎性疾病與NETs過量產生或清除障礙密切相關[3-5]。現從NETs的形成、抗菌性及其在炎性疾病中的意義等進行概述。

1 NETs概述

1.1NETs的組分及效應 NETs是中性粒細胞受刺激,核內染色質解聚后釋放到胞外的網狀結構，面積是濃縮染色質的3～5倍，其以DNA為骨架，上鑲嵌有組蛋白以及超過30種初級和次級顆粒組分[6]，其中一些組分具有殺菌活性，如彈性蛋白酶、髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、組織蛋白酶G、乳鐵蛋白、穿透素3、明膠酶、蛋白酶3、抗菌肽、肽聚糖結合蛋白等[7]，這些鑲嵌在DNA骨架上的蛋白增強了NETs的抗微生物作用，可作為生物酶和殺菌劑，其被釋放到組織和血液時，能夠引起炎癥反應和血栓形成，從而加重宿主損傷。在炎性相關的自身免疫性疾病中，NETs組分也可作為抗原誘導免疫反應[8]。因此，NETs在炎性疾病中的效應具有雙重屬性。

1.2NETs形成機制和影響因素 中性粒細胞胞外誘捕網是區別于凋亡和壞死的另一條細胞死亡途徑，隨后對其進行了詳細研究，并命名為NETosis。病原微生物、脂多糖、佛波酯、活化的血小板等都能誘導中性粒細胞產生NETs。有報道指出，組織損傷引起全身炎癥反應的患者的血漿也可以刺激中性粒細胞釋放NETs，其原因可能與血漿中白細胞介素(interleukin，IL)-1β、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)等炎癥細胞因子表達的增多有關[9]。

目前，NETs產生的分子機制尚未完全清楚。已知的NETosis有3種模式:①自殺性NETosis，持續2～4 h，是目前了解的最多的一種模式[10]。應用佛波酯刺激中性粒細胞后激活還原型輔酶氧化酶復合物，促進活性氧的生成。同時細胞質內Ca2+增加,其作為肽基精氨酸脫氨酶4的輔因子，加速組蛋白瓜氨酸化及染色質解聚[8]。活性氧作為自殺性NETosis的第二信使，能促進核膜裂解。此外，嗜天青顆粒釋放的彈性蛋白酶和MPO進入細胞核，促進染色體解聚并進入細胞質，然后與胞質蛋白和顆粒毒素結合釋放到細胞外[9]。活性氧的產生和肽基精氨酸脫氨酶4誘導的組蛋白瓜氨酸化是自殺性NETosis的關鍵。②細胞核DNA釋放式NETosis模式，此過程持續5～60 min，不伴有核或質膜的破壞，且不依賴于活性氧的產生。NETosis發生后，中性粒細胞仍能夠吞噬病原體，且其壽命不會因為DNA損傷而受影響。③線粒體DNA被釋式NETosis， 此過程依賴活性氧的產生，中性粒細胞受到C5a或脂多糖刺激15 min內80%會形成NETs[9]。

1.3NETS的檢測 NETs的檢測分為定性檢測和定量檢測，目前主要進行定性檢測。佛波酯刺激中性粒細胞后，透射電子鏡下可觀察到細胞核和顆粒的崩解；也可用單克隆抗體標記抗組蛋白-DNA復合物、MPO，或采用特殊染料二脒基苯基吲哚和SYBR Green對核酸進行染色，在熒光共聚焦顯微鏡觀察到熒光現象可證實NETs的產生[11]。

有研究報道了一種靈敏度高且可自動化檢測NETs的定量方法，其采用Sytox green對人中性粒細胞的PKH26和胞外DNA進行標記，然后將細胞固定并使用三維共焦激光掃描顯微鏡成像，最后使用數字圖像分析量化NETs的釋放[12]。此外，還可應用PicoGreen dsDNA Quantitation kit對血漿、血清中NETs的水平進行定量檢測[13]。

1.4NETs的抗感染作用 中性粒細胞是感染早期發揮免疫效應的主力細胞，被刺激后釋放的胞外網狀結構可捕捉病原體，同時也可幫助其他細胞發揮吞噬作用，其上附著的大量抗菌蛋白可以殺滅病原體[3]。NETs經脫氧核糖核酸酶Ⅰ(desoxyribonuclease Ⅰ，DNaseⅠ)處理會失去滅菌作用，因此DNA結構對殺滅病原體有核心作用[10]。NETs包含的DNA和組蛋白具有內在的抗微生物活性，DNA作為陽離子螯合劑，能夠破壞銅綠假單胞菌的外膜和內膜[14]。組蛋白2A被認為是最有效的抗微生物劑之一，特別是對大腸埃希菌、志賀菌屬、腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌等效果顯著。組蛋白的抗微生物作用不僅針對細菌，對寄生蟲同樣有效。NETs還可通過分解細胞因子和炎癥趨化因子減輕炎癥反應，通過促凝血限制病原體擴散[11,15]。長久的進化壓力也使一些病原體產生了一些逃避NETs的機制。有研究發現，病原體可通過改變表面電荷躲避NETs的捕捉[16]。肺炎鏈球菌產生的毒力因子能夠降解NETs的DNA骨架，幫助肺炎鏈球菌從NETs上逃脫，促進細菌從上呼吸道傳播到肺，然后向血液擴散。

2 NETs與感染性疾病

2.1NETs與細菌感染 細菌、病毒、寄生蟲以及真菌都可以誘導炎癥過程，因細菌及其代謝產物是第1個發現可以誘導NET形成的病原體，因此研究的較為深入。金黃色葡萄球菌是一種革蘭陽性菌，由于其具有逃避免疫系統、抵抗抗生素治療的能力而被稱為“超細菌”，能引起諸如骨髓炎、心內膜炎、菌血癥等嚴重的炎癥反應。在Brinkmann等[3]的試驗中，金黃色葡萄球菌首次被用作NETosis的刺激物。NETs可捕獲病原體，并阻礙其擴散，發揮抗菌作用。在局部感染的早期階段或膿毒癥中，NETs的誘捕功能可能有助于膿腫的形成，并限制病原體傳播。一旦失去NETs的遏制，會導致疾病進展。Thmmavongsa等[17]報道，金黃色葡萄球菌誘導產生的NETs對巨噬細胞有細胞毒性作用，可以誘導細胞死亡；金黃色葡萄球菌還可以分泌毒性因子，逃避宿主免疫系統。因此，NETs與呼吸系統繼發感染導致的疾病進展(如慢性阻塞性肺疾病、肺炎等)以及并發癥等相關[16]。

大腸埃希菌是一種革蘭陰性細菌，與很多疾病如腸炎、尿路感染、腦膜炎、敗血癥等的發病相關[18]。Czaikoski等[19]發現，大腸埃希菌引發的膿毒性休克患者的血清能刺激中性粒細胞，顯著誘導NETs的生成。Marin-Esteban等[20]研究嬰兒腹瀉時發現，NETs能夠捕獲、固定以及殺滅細菌，但當中性粒細胞與上皮細胞系CaCo-2/TC7及細菌共同培養時，中性粒細胞能產生NETs，并損害上皮細胞。因此認為NETs能夠損傷腸上皮，并與其他腸道炎性疾病相關。

2.2NETs與病毒感染 NETs在抗病毒反應中的作用尚不清楚。最近的研究才開始闡明中性粒細胞參與宿主抗病毒反應的效應機制。盡管涉及抗病毒活性的幾個因子(包括MPO和α-防御素)在NETs中表達，但很少有研究描述NETs在病毒清除中的作用。Hoeksema等[21]報道，組蛋白對流感病毒感染具有保護作用，具體表現為富含精氨酸的組蛋白具有針對季節性H3N2和H1N1的強效抗病毒活性，可通過與病毒顆粒直接作用，進而抑制病毒的攝取和復制。研究發現，人類免疫缺陷病毒顆粒被NETs捕獲后黏附在網狀結構上，從而阻止病毒傳播，增加了NETs殺傷微生物組分的時間；此外人類免疫缺陷病毒誘導NETs生成的過程中，Toll樣受體(Toll-like receptors,TLR)8與TLR7的銜接誘導了活性氧的產生[22]。在呼吸道合胞病毒引起的下呼吸道嚴重疾病患者的支氣管肺泡灌洗液中也發現了NETs的存在，NET的形成可以防止呼吸道合胞病毒傳播，但卻無法殺死病毒；此外，呼吸道合胞病毒F蛋白也能通過TLR4誘導NETs，而這些NETs作為病毒儲存庫，其存在可能會加劇炎癥反應，促進氣道閉塞[23]。總之，NETs具有監控病毒并阻止其擴散以及感染靶細胞的作用。

2.3NETs與其他病原體感染 真菌也可以誘導NETs的生成。新型隱球菌是一種機會性致病真菌，可導致隱球菌病和腦膜腦炎。新型隱球菌的莢膜多糖賦予其調節宿主免疫系統的能力，特別是能調節NETs的生成，莢膜酸性多糖通過抑制NETs的產生增強菌株的毒力[24]。弓形蟲是弓形體病的病原體，因攝入受污染的食物而致病。弓形蟲感染可誘導中性粒細胞向感染部位募集。在鼻內感染的小鼠模型中，中性粒細胞通過NETs捕獲和消滅病原體，并限制病原體的傳播[25]。

3 NETs與非感染性炎性疾病

3.1痛風 痛風是一種自身炎性疾病，其特征是關節中沉積的尿酸單鈉晶體吸引白細胞形成的痛風石介導的組織損傷。尿酸單鈉晶體可以刺激中性粒細胞分泌IL-8、TNF-α以及IL-6，這些細胞因子不僅能促進中性粒細胞募集，還能誘導NETs形成。與其他疾病一樣，NETs可促進痛風的炎癥反應[26]；與其他疾病不同的是，NETs在終止痛風發作中也具有重要作用。首先，NETosis預示了中性粒細胞的死亡，因此降低了中性粒細胞的密度；其次，NETs特有的網狀結構封閉了尿酸單鈉晶體，保護其免受吞噬；最后，NETs衍生的蛋白酶可使細胞因子失活，并消除其促炎效應[27]。

3.2RA RA是一種導致關節軟骨和骨損傷的持續性滑膜炎，也是一種全身性自身免疫性疾病。RA患者的滑膜液中浸潤了大量可以形成NETs的中性粒細胞，且RA患者外周血中中性粒細胞也較健康受試者更易產生NETs[28]。與其他自身免疫性疾病一樣，NETs也可能是細胞外自身抗原的來源,如在RA患者的滑膜中可檢測到組蛋白瓜氨酸化產生的瓜氨酸化肽在中性粒細胞的過表達。此類瓜氨酸化肽能被α-瓜氨酸肽抗體識別，形成誘導NETs形成的免疫復合物，導致中性粒細胞顆粒以及胞質自身抗原在關節的釋放[29]。中性粒細胞顆粒以及胞質自身抗原也可釋放核因子κB配體和B細胞激活因子受體激活劑，分別激活破骨細胞和B細胞，在關節中誘導過度免疫反應和組織損傷[30]。RA患者的血清中α-瓜氨酸肽抗體在疾病的早期階段，甚至在臨床癥狀出現前就能檢測到，是RA的早期生物標志物。Khandpur等[28]發現，除NETs誘導的自身抗體外，IL-17和TNF-α也具有這種能力，并且這些細胞因子在RA患者的血清中過表達。

3.3系統性紅斑狼瘡 系統性紅斑狼瘡是一種自身免疫性炎性疾病，以漿樣樹突狀細胞的激活和自身抗體的產生為特征。NETs參與了系統性紅斑狼瘡的病理過程。在系統性紅斑狼瘡患者的體內，來自NETosis和凋亡細胞的核酸物質因清除失敗而沉積在患者體內，這些自身抗原通過濾泡樹突狀細胞呈遞給次級淋巴器官生發中心的自體反應性B細胞，產生針對NETs細胞成分的自身抗體[31]。產生的免疫復合物可通過Ⅱ型Fcγ受體介導的胞吞作用，通過TLR7和TLR9途徑激活漿樣樹突狀細胞分泌IFN-α，刺激更多的NETs產生，同時也可激活補體系統，并誘導炎癥、血管損傷以及血栓形成等[32]。研究證實，狼瘡性腎炎的進展可能與體內存在DNaseⅠ抑制劑以及與NETs結合的自身抗體，導致機體清除NETs的能力下降有關[33]。

3.4小血管炎 小血管炎是一種病因不明的全身性疾病，是影響小動脈、小靜脈以及毛細血管的炎癥[32]。在大部分小血管炎患者中可檢測到抗中性粒細胞胞質抗體(antineutrophil cytoplasmic antibody，ANCA)，長期接觸NETosis釋放的蛋白質如MPO、蛋白酶3、組蛋白等是產生ANCA的主要原因，這些蛋白可促進炎癥介質激活補體系統，并導致內皮損傷。NETs中的MPO和蛋白酶3是ANCA的特異性靶抗原，這使免疫系統陷入一個惡性循環，使炎癥持續存在。另外，高水平的DNA-MPO復合物與疾病活動相關，α-蛋白酶3和α-MPO ANCA在疾病活動期間誘導NETosis，也可使免疫系統陷入惡性循環，加重小血管炎患者病情[33]。

3.51型糖尿病(type 1 diabetes mellitus,T1DM) T1DM是一種自身免疫性疾病,先天免疫應答細胞在其發病中起重要作用。在被炎癥細胞浸潤的胰腺中發現的中性粒細胞和樹突狀細胞等能合成α干擾素和活性氧，進而促進促炎癥細胞因子的合成[34]。在糖尿病患者中，TNF-α升高激活中性粒細胞形成NETs，進而釋放中性粒細胞絲氨酸蛋白酶、中性粒細胞彈性蛋白酶以及蛋白酶3等細胞內容物[34]。因此，T1DM患者血清中中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3的水平和酶活性均升高，而它們在IFN-α、IL-1β、IL-18的成熟和釋放以及TLRs的表達和活化中均有重要作用[35]。中性粒細胞彈性蛋白酶和蛋白酶3在T1DM發病中也起著重要作用，其能促進中性粒細胞募集到炎癥部位，形成負反饋，促進自身免疫性糖尿病的發生。研究表明，T1DM患者和存在患病風險的個體均患有中性粒細胞減少癥，其原因可能部分歸因于NETosis的增加和胰腺組織中中性粒細胞的浸潤[35]。炎癥急性期可抑制組織修復，因此NETs促進炎癥和組織破壞的作用可以解釋其延緩糖尿病患者切口的愈合。NETosis需要葡萄糖提供能量，因此糖尿病患者的中性粒細胞更易釋放NETs，這可能與血糖升高對還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶和線粒體的影響引起活性氧爆發有關，但更高的血糖水平會抑制NETosis[36]。

4 NETs與其他疾病

在子癇前期、血栓性疾病、腫瘤等多種疾病中均有NETs的生成。研究顯示,NETosis在腫瘤的發生、發展中具有重要作用，因此推測DNaseⅠ治療可能對腫瘤有效[4,37]。在胰腺癌中也檢測到了NETs的存在，發現DNaseⅠ治療可減輕炎癥并抑制腫瘤生長[37]。血栓形成也與NETs相關，NETs中的核苷酸、酶類物質均為促凝成分，組蛋白有助于血栓形成并促進組織因子產生，同時激活凝血酶。在小鼠模型中已證實活化的血小板可刺激NETs生成，并引起深靜脈血栓形成[38]。在動脈粥樣硬化的早期炎癥階段，微小的膽固醇晶體可誘導NETs生成，斑塊中的巨噬細胞可促進炎癥反應并活化血小板，加重動脈斑塊病變引發的血管卒中事件[39]。近年來，在多種心血管疾病中已證實有NETs的生成，且其發生與炎癥反應、血液高凝狀態有關[15]。對小鼠阿爾茨海默病模型的研究發現，中性粒細胞的消耗或阻斷中性粒細胞募集可促進阿爾茨海默病小鼠的病理學改善，同時改善認知功能[40]。然而，NETs是否以及如何影響神經元變性還有待進一步研究。

5 結 語

中性粒細胞是機體重要的免疫細胞，在機體抗感染免疫反應中至關重要。隨著對中性粒細胞研究的進一步深入，NETs作為中性粒細胞的一種新型抗菌方式，一直處于中性粒細胞生物學研究領域的前沿。NETs不僅在炎性疾病的發病中發揮重要作用，同時也在眾多非感染性炎性疾病中擔任重要角色，但目前關于NETs的分子機制和信號通路仍不十分明確。總結NETs在疾病中的作用有助于更好地理解NETs與一些疾病的關系，為疾病的預防和治療提供提新的思路。