石油污染土壤微生物聯合修復技術研究進展＊

周龍濤 王群立 賈 悅 張 軍 馬 嵐 劉 博

(中國石油新疆油田公司工程技術研究院)

0 引 言

土壤中石油污染物的去除主要有物理、化學和生物三種技術方法。其中，物理和化學技術的修復周期短、效果好，但修復成本高，且具有二次污染環境可能。生物修復技術因操作簡單、成本低、無二次污染、可在原位修復等優點，受到越來越多的關注。生物修復技術包括微生物修復、植物修復、動物修復及微生物聯合修復。微生物修復具有完整的降解污染物能力，但需要外界提供能量，易受環境影響；植物修復不需要外界提供能量，污染物通過根系吸收和根際效應降解，受植物生長規律限制明顯；動物修復通過增強土壤的通透性和肥力，促進微生物、植物的降解效率，自身降解效率較低。大量研究表明聯合修復技術較單一生物修復技術具有更好的修復效果、更短的修復時間。微生物的可降解所有石油組分特點，為開展微生物聯合修復技術提供基礎，常見的微生物聯合修復技術主要為：植物-微生物、電動-微生物、氧化-微生物和表面活性劑強化微生物。

1 植物-微生物聯合修復技術

植物-微生物聯合修復技術是利用植物-微生物協同作用形成的污染物富集、固定、降解技術。植物為其相關的根際細菌和內生細菌提供生長繁殖的場所和營養，細菌通過降解和降低有機污染物毒性來幫助植物克服污染物的脅迫反應，增加植物地上部分和根系的生物量，而且可以促進植物生長。劉鑫[1]研究表明，在PAHs污染土壤或者大田試驗條件下，接種菌株SL-1可明顯促進紫花苜蓿的生長，并且微生物-植物聯合修復降解PAHs比微生物或者植物修復更有效。傅婉秋等[2]將植物-微生物修復技術分為植物-內生菌、植物-菌根菌、植物-根際微生物3種聯合修復體系。內生菌是存在于植物組織內部，不引發宿主表現出明顯感染癥狀的生物菌群，主要包括細菌、真菌、放線菌。吳春雅等[3]內生菌主要通過促進宿主植物生長，改善植物攝取污染物能力和酶促降解污染物等方法提高植物去除污染物的能力。Pawlik等[4]從百脈根和月見草中分離出26種降解烴類的內生菌，這些內生菌均對植物的生長均有廣泛的促進作用，超過40%的菌株具有1-氨基環丙烷-1-羧酸脫氨酶基因，約20%菌株可以用正十六烷作為唯一碳源，并提出通過優選內生菌株來增強植物對碳氫污染場地的修復能力。菌根菌是指能使植物根系形成菌根的真菌；叢枝菌根真菌(AMF)是廣泛存在于陸地生態系統中的植物共生菌，可與宿主植物形成依賴于碳水化合物-礦質養分交換的專性共生體，植物為AMF提供生長所需碳水化合物，AMF根外菌絲幫助植物吸收土壤中的礦質養分，特別是土壤中移動性較差，根系吸收相對困難的磷、銅、鋅等[5]。Meglouli[6]將土著和商業菌根接種到苜蓿和高羊茅上，結果表明土著和商業菌根菌定植于植物根系，菌根的生長反映取決于接種物的種類，接種土著菌更能增加細菌的豐度。土壤微生物活性的增加是降低污染物毒性當量濃度的主要原因。Xun等[7]研究了植物生長促進菌和叢枝菌根真菌對燕麥修復鹽堿污染土壤的影響，結果表明，接種植物生長促進菌和叢枝菌根真菌可以增加植物的干重和高度，增加抗氧化酶的活性，增強植物對有害的碳氫化合物污染物的耐受性，在中度污染土壤中石油總烴的降解率達到49.73%。根際微生物是指緊密附著于根際土壤顆粒中的微生物，以細菌為主。在植物-細菌組合中，持久性有機污染物可以被植物相關細菌降解，其中主要降解菌是根際細菌[8]。Banks等[9]研究表明，石油污染土壤微生物群落在數量上受植被和污染物濃度的影響，植被土壤微生物群落可能具有更豐富的多樣性，能夠利用多種碳源。Pritchina等[10]研究表明，在高污染土壤中南瓜、西葫蘆、生菜根際的微生物群落結構主要受土壤污染程度的影響，而小麥根際微生物群落的形成以植物效應為主。Shahsavari等[11]從豆類、草和農作物篩選出11種植物進行了1%柴油/原油混合污染土壤耐受試驗，出苗率、芽長、根長和根/芽生物量結果表明玉米和小麥的適應性最好。玉米和小麥植物根際的存在使土壤微生物群落結構的變化，出現了有助于修復根際石油烴的真菌和alkB細菌。王亞男等[12]研究表明，萱草對石油烴含量40 000 mg/kg具有良好的耐性，暴露在石油烴中會引起萱草根系某些代謝物產生顯著的變化，根系代謝物中的喃葡萄糖、丁酸、果糖、己二酸、核糖、葡萄糖酸、賴氨酸對土壤中TPHs的去除起到了關鍵作用。潘聲旺等[13]研究表明，黑麥草根系分泌物為微生物代謝提供營養和能量物質，促進了根際微生物種群數量的增加，強化了根際微生物的降解效能。

2 電動-微生物聯合修復技術

電動修復技術主要包括電化學氧化、電泳、電滲析以及電遷移4種修復機制，對于石油烴這種移動性能較差、黏著性較強的非離子型有機污染物，主要通過電化學氧化降解，其與微生物聯合修復時，電場可促進土壤中微生物的遷移以及營養物質的運輸，明顯的提高微生物的代謝活性，從而提高污染物的去除效率。Lear等[14]研究表明直流電場對微生物健康沒有明顯的有害作用，反而可以促進微生物的遷移和營養物質的輸送，證明了電動與微生物技術聯合修復的可行性。Li等[15]篩選了可以在電場環境下生長的PAHs降解菌PB4和FB6，并接種到184.95 mg/kg PAHs污染的土壤中進行修復實驗。結果表明，在電場條件下PB4和FB6的降解率比單獨使用PB4和FB6高15.4%和14%，適用于重質PAHs污染土壤的降解。羅啟仕等[16]研究表明，非均勻電場能有效地促進土壤中Rm1021-GFP 細菌的運移，其主要機理是電泳、介電泳和隨電滲析流遷移，主要影響因素是土壤介質、電壓梯度和電極反應。Wick等[17]研究表明，低電流強度對微生物活性無明顯作用，當電流強度達到1.67 A/m2時，可以明顯提高微生物的代謝活性。李婷婷等[18]在5 min切換一次電極的完全對稱電場作用下，對50 mg/g的石油污染土壤進行了電動-微生物修復實驗，電壓梯度1 V/cm時，土壤中有效氮、有效磷、有效鉀的平均值分別是對照組的1.3，1.6和1.2倍。土壤的pH值穩定在6.3±0.2，溫度升高2～3℃，石油降解菌數量增加，修復60 d后石油去除率達到33.42%，是對照組的2.4倍。2016年進一步指出，周期性切換電極可以提供良好的土壤環境，提高石油污染土壤的修復效率[19]。楊波波[20]研究表明，最佳的修復條件為，電極材料為石墨電極、傳輸方式為直插式、電場強度為100 V/m，變換電場電極的正負極和脈沖電場對含油土壤的處理效果影響不顯著，耦合結合表面活性劑和翻堆處理效果顯著。黃廷林等[21]對陜北石油污染土壤進行了微生物和外加電場聯合修復的實驗研究，54 d后施加電場的石油降解率比不加電場的提高12%，土壤中的直鏈飽和烴基本被去除，降解促進作用主要表現在初期，降解后期促進作用不明顯，適宜的電場強度為300 V/m。嵇婷婷等[22]研究表明，電動-微生物聯合修復石油膠質污染土壤60 d后，膠質的降解率為20%左右，比微生物修復效果高3倍以上。從發芽率情況可知，聯合作用能有效降低膠質的毒性，且陰極區的效果最好。王冰等[23]研究發現，電化學氧化作用可以促使膠質結構發生變化，適當的電流可以促進微生物新陳代謝，為微生物提供適宜的pH、水分、溫度等生存條件，增強微生物活性，微生物數量增長期主要集中于0～20 d，20～50 d增長速率減慢，50 d后微生物數量趨于穩定。張靜[24]發現，采用切換電極的通電方式修復石油污染鹽堿土壤，可有效地避免酸堿極化現象的發生，將土壤pH維持在中性水平上，電解反應會引起土壤水分的損失，需定時補充土壤水分，整個電動-微生物修復過程中單位質量土壤消耗電能4.84 kW·h，成本相對較低。

3 氧化-微生物聯合修復技術

氧化-微生物修復技術主要先通過化學氧化預處理將土壤中難降解的大分子有機污染物轉化為低毒或無毒的小分子易處理物質，或者直接降解成CO2、H2O等，然后再進行生物修復。目前常用的氧化劑包括：臭氧、過氧化氫、高錳酸鹽、過硫酸鹽及類Fenton試劑等。Sutton等[25]認為與僅使用化學或生物修復相比，原位化學氧化和生物聯合修復是更廣泛、快速和經濟的污染土壤修復方法。Kulik等[26]對PAHs污染土壤按230 mg/kg臭氧進行預氧化后，在20 ℃陰暗處進行了8周的好氧生物降解實驗，結果表明，臭氧與微生物聯合修復沙土和腐質土中PAHs降解比單一臭氧降解率分別提高了22%和40%，比單一微生物降解率提高了27%和16%。蔡月華等[27]指出臭氧預氧化耦合微生物降解技術的優點是臭氧擴散效率高、影響半徑大，利于與土壤中的PAHs接觸，缺點是臭氧的半衰期短、傳輸距離短、腐蝕性強且需現場生成。魏德洲等[28]在石油污染土壤的微生物治理過程中發現，加入適量的H2O2可以增加近3倍的總除油率。蔡武[29]以杭州半山鋼鐵基地表層土壤為實驗對象，對比不同濃度雙氧水、改性Fenton、活化過硫酸鈉、高錳酸鉀四種氧化劑對多環芳烴的氧化效果，結果表明高錳酸鉀處理時對土壤影響最小，氧化效率較高，但過多使用會影響土壤的通透性。Mora等[30]研究表明，高濃度的過硫酸鹽對土壤的pH、細菌數量和群落結構有重要影響，高濃度的過硫酸鹽抑制生物降解過程，低濃度的過硫酸鹽可以縮短生物適應時間，促進生物修復菲污染土壤的時間，且對土壤的理化和生物特性沒有負面影響。張曉慧等[31]研究果表明，加熱活化和調節pH活化過硫酸鹽強化微生物處理石油污染土壤比單獨用微生物降解率提高10%，最優活化溫度30℃，最優pH值是3和10，其中pH值對C10～C13、C19～C24組分降解的影響較大，溫度對C14～C18組分降解的影響較大。肖鵬飛等[32]認為有機污染物修復的過硫酸鹽活化方法分為過渡金屬離子活化、氧化劑活化、堿活化、熱活化及聯合活化等，活化過硫酸鹽的影響因素為過硫酸鹽的用量、初始pH值、反應時間和添加方式。李社鋒等[33]指出活化過硫酸鹽具有選擇性氧化有機污染物的特點，在PAHs類污染土壤修復時，可以考慮用過渡金屬活化、熱活化方式。吳昊等[34]研究表明，Fe2+活化過硫酸鈉對TPH的去除效果最好，堿活化次之，H2O2活化效果一般，熱活化效果最差，Fe2+活化過硫酸鈉去除土壤中的TPH基本在5 min內完成，一次添加氧化劑的降解效果優于多次添加，最佳的過硫酸鈉用量為2.5 mmol/g。高春陽等[35]以H2O2和Na2CO3·1.5H2O2活化Na2S2O4降解原油污染土壤研究表明，氧化后污染物中飽和烴占比增加5.28%～11.93%，芳香烴、膠質、瀝青質的占比分別降低了0.10%～2.53%，2.53%～3.80%，0.94%～3.43%，添加氧化劑后土壤中大部分土著微生物會被氧化劑殺死，90 d后基本可以恢復初始水平。Ojinnnaka等[36]研究表明，Fenton試劑能有效去除原油污染土壤中的碳氫化合物，特別是在酸性環境中。鄭洪貴[37]研究表明，改性Fenton化學氧化不僅不會降低土壤中微生物的活性，而且可以提高后續生物修復的效率。徐金蘭等[38]研究了Fenton改性修復石油污土壤中存在H2O2和Fe2+濃度最優值，過高的濃度會加大土壤中SOM的氧化率。低濃度多次投加H2O2的改性方法，不僅能大幅度提高TPH的降解效率，而且降低了破壞SOM的風險。韓旭等[39]研究了Fenton氧化-微生物聯合修復對含TPH(W)4%，8%，11%土壤的修復效果，在分別加入最佳H2O2量3，4，4 mol/L(Fe2+加入量0.04 mol/L)處理后，20 d后TPH的最高去除率分別為88.8%，65.0%，47.7%，較Fenton氧化或微生物法均有很大程度的提高，且減少了降解時間，增加了土壤有機質。

4 表面活性劑強化微生物修復技術

土壤對石油烴的吸附是限制生物利用性的主要因素。表面活性劑的一方面具有較強的增溶作用，可以提高傳質速率；另一方面可以改變微生物細胞膜流動性，促進微生物降解酶活性改變及基因表達，從而提高降石油烴的降解效率。Eliora[40]認為表面活性劑不但可以增加烴類物質的溶解，而且可以增加烴類物質的生物可利用性。錢欣平[41]指出，表面活性劑可以促進難溶烴類的分散和吸收，調節細胞表面與烴類之間的親和力，一些菌種產生的表面活性劑甚至對其他菌株的生長有抑制作用。趙淑梅等[42]將產生生物表面活性劑的生物來源分為三大類：完全以烷烴為碳源、僅以水溶性底物為碳源、以烷烴和水溶性底物為碳源。并指出生物表面活性劑可以強化生物修復過程，能將烴類物質乳化，進而促進其降解。牛明芬等[43]從大慶油田油泥樣品中篩選出3株能產生表面活性劑的細菌，初步鑒定為地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和銅綠假單胞菌，其產生的表面活性劑可耐受高溫和高濃度的鹽，對pH值的適應范圍廣，處理72 h后石油的去除率分別達到62.31%，81.69%和71.38%。Das等[44]研究了嗜熱苦菜桿菌DM-4和假單孢桿菌M和NM對原油的降解，結果表明其既是石油降解菌同時也產生表面活性劑，其中假單孢桿菌比枯草桿菌修復效果更好，且修復過程中pH值基本保持不變。Olivera等[45]對表面活性劑產生菌進行顯微鏡觀察和細胞表明的疏水性測定，發現食烷菌降解烴類物質的初期并不產生表面活性劑，主要依靠食烷菌黏附在烴類上進行降解，后期分泌表面活性劑幫助細菌脫離烴類，促使烴類化合物表面細菌的更替，從而促進烴類降解。Jorfi等[46]應用銅綠假單胞菌SP4產生的表面活性劑對濃度為500 mg/kg芘污染的土壤進行修復，其芘去除率達到84.6%，未添加表面活性劑的去除率為59.8%。吳小紅等[47]研究表明，鼠李糖脂能促進石油烴類降解菌的生長，可以促進X4菌株對石油烴的降解。劉魏巍等[48]通過盆栽實驗研究了生物表面活性劑強化微生物修復PAHs污染土壤的效果，結果表明，添加PAHs專性降解菌(DB)和鼠李糖脂(RH)的PAHs降解率高于單獨使用一種，DB主要提高土壤中的脫氫酶、多酚氧化酶活性，RH主要提高PAHs的生物可利用性。Mesbaiah等[49]研究了從污染土壤中篩選出的類芽孢桿菌1C的特點，該菌可以將PAHs作為唯一碳源和能源，其產生的表面活性可以提高PAHs的溶解度，在較大的pH值、溫度和鹽度范圍內性能穩定，而且對病原體顯示出顯著的抗菌活性，可用于修復多環芳烴污染。Lladó等[50]研究表明，非離子表面活性劑Brj30的存在阻礙了放線菌和擬桿菌的增殖。周敏等[51]研究表明，芽孢桿菌ZG0427產生的脂肽類陰離子表面活性劑對石油降解菌YM15及KB1的作用有明顯差別，對前者的促進作用明顯，而對后者在質量濃度較低時即表現出抑制作用。王凌文[52]研究了鼠李糖脂、SDBS和Tween80對PAHs污染場地生物群落結構和活性的影響，發現表面活性劑可以增加群落中細菌的數量，優化細菌的群落結構，改善群落土著細菌活性。修復90 d后PAHs去除率達到80.9%～92.4%，降解率是未添加表面活性劑處理場地的3～4倍，作用效果為鼠李糖脂>Tween80>SDBS，最佳濃度分別為10，50，50 mg/kg。榮璐閣等[53]研究了表面活性劑對甲基營養型芽孢桿菌修復柴油污染土壤的影響，結果表明SDBC和SDS對甲基營養型芽孢桿菌具有抑制作用，Tween80和RL起到了促進作用，2 000 mg/L的Tween80比500 mg/L的RL強化甲基營養型芽孢桿菌修復效率更高，且經濟可行。

5 展 望

微生物聯合修復效率更高，具有廣闊的研究前景。目前國內外已開展了大量的微生物聯合修復技術研究，形成了多項與微生物聯合的修復技術，且室內應用效果良好。但在大田試驗中，受環境因素影響，菌株的存活率和生物活性降低，導致修復效率低、修復周期長。為盡快發揮微生物聯合修復優勢，實現工業化推廣應用，需加強以下幾個方面的研究。

1)微生物聯合修復技術中，嗜油微生物在石油污染土壤中生長繁殖是降解的前提，應加強高效石油降解菌的篩選、馴化和培養，培育出適用于高污染物濃度、極端溫度條件的菌株；目前關于好氧嗜油菌的研究較多，而石油污染土壤中氧氣濃度低，厭氧嗜油菌的修復具有技術優勢，應加強厭氧嗜油菌株的篩選研究；表面活性劑可促進嗜油菌降解效果，應加強促進高效嗜油菌生長的表面活性劑產生菌和能產生表面活性劑的嗜油菌的篩選研究；加強微生物修復機理研究，借助基因工程技術，構建嗜油工程菌，提高菌株的環境耐受力和修復效率。

2)加強微生物與各修復技術的協同修復機理研究，根據聯合修復技術的特點，確定聯合修復技術的適用范圍，優化修復工藝，探索多種技術聯合修復的可能；開展不同聯合修復技術的橫向對比研究，評價確定不同污染物組分、濃度和土質條件下的經濟適用修復技術。

3)目前微生物修復技術的研究主要在實驗室內進行，現場環境與實驗室環境差異較大，應加強現場修復工藝的研究，尤其是原位修復工藝的研究，為微生物生長繁殖的提供適宜環境，盡快將研究成果應用到現場中，切實解決石油污染土壤問題。