MicroRNA-17通過調節MMP-2影響滋養層細胞的侵襲與遷移

黃志蓉 陳育娟

（廈門大學附屬婦女兒童醫院，廈門市婦幼保健院圍產保健科，福建 廈門 361003）

妊娠期高血壓疾病是妊娠與血壓升高并存的一組疾病[1]。這些疾病幾乎占所有孕產婦死亡的10%。有研究發現，胎盤滋養層細胞的過度遷移和侵襲與妊娠高血壓的發生緊密關聯[2]。

MicroRNA（miRNA）是一類由19-24個核苷酸組成的小非編碼RNA，并參與許多基本的細胞過程[3]。已有多項研究發現miRNAs參與妊娠期高血壓疾病發生與發展[4]。約有600個miRNA在人類正常胎盤和驚厥前期胎盤中表達，其中miR-17被發現在重度子癇前期患者胎盤中表達降低[5]，提示miR-17可能參與滋養細胞侵襲、遷移等功能異常過程，但具體分子機制仍需不清楚。本實驗通過上調及下調滋養層細胞HTR8-SVneo內miR-17的表達水平，檢測滋養層細胞遷移和侵襲功能變化，并檢測其對基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）蛋白表達的影響，探討miR-17和MMP-2在滋養細胞的侵襲和遷移能力中的作用，為臨床妊娠高血壓的靶點治療提供有力的實驗室依據。

1 材料與方法

1.1 細胞系：人類滋養層細胞系HTR8-SVneo由本實驗室保存。

1.2 細胞培養：HTR8-SVneo細胞培養于含有10%胎牛血清、青霉素100 U/mL及鏈霉素100 μg/mL的DMEM培養基（美國Gibco公司）中。培養瓶置于37 ℃，5% CO2培養箱，每2～ 3 d進行一次細胞傳代。

1.3 細胞轉染：通過細胞轉染將miR-17 mimic或miR-17 inhibitor或pcDNA-MMP2（上海吉瑪基因）轉染至HTR8-SVneo細胞。具體過程為，接種于6孔板的HTR8-SVneo細胞生長至50%～70%密度時，用Lipfectamine 3000將上述RNA或DNA轉染至細胞，24 h或48 h后提取RNA或蛋白進行后續實驗。

1.4 熒光定量RT-PCR檢測基因表達：提取HTR8-SVneo細胞中總RNA，經RNA濃度測定后，通過逆轉錄試劑盒，以總RNA為模板，將其逆轉錄為cDNA。以U6或磷酸甘油醛脫氫酶分子為內參，采用SYBR Green PCR試劑盒進行實時定量PCR檢測miR-17或MMP-2表達水平。根據2-ΔΔCt方法計算相對表達水平，實驗重復3次。

1.5 Western blot檢測蛋白表達量：提取HTR8-SVneo細胞總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度，取等量蛋白加入SDS-PAGE膠孔中，待蛋白條帶分離后，用孔徑0.45 μm的PVDF膜進行蛋白轉膜。TBST漂洗3次，用封閉血清封閉1 h，以1∶1000濃度加入兔（鼠）抗人MMP-2一抗或抗β-actin一抗，4 ℃孵育過夜，常溫下TBST洗膜3次，辣根過氧化物酶標記二抗孵育后ECL化學發光法檢測，Quantity one軟件分析。

1.6 Transwell侵襲實驗：為消除細胞增殖對細胞侵襲實驗的影響，HTR8-SVneo細胞經過血清饑餓后，羥基脲作用12 h，待轉染不同RNA或質粒后，配制細胞懸液并計數（5×104個/mL）。向鋪有Matrigel基質膠的Transwell上室（0.8 μm）加入200 μL細胞懸液，下室加入含有10% FBS的培養液500 μL，培養12 h。以棉簽擦去上層未穿透膜的細胞，取下Transwell上室，用多聚甲醛室溫固定5 min，2 μg/mL的DAPI染核，熒光顯微鏡每組隨機取5個視野觀察計數并記錄穿膜細胞數。

1.7 劃痕實驗：為消除細胞增殖對細胞侵襲實驗的影響，HTR8-SVneo細胞經過血清饑餓后，羥基脲作用12 h。將細胞分組轉染不同RNA或質粒后，用100 μL槍頭垂直孔板劃線，棄細胞培養液，PBS沖洗孔板3次，繼續在細胞培養箱中培養，拍照記錄培0 h和24 h的細胞圖片。

1.8 雙熒光素酶實驗：通過NCBI查詢MMP-2基因3'-UTR序列后，設計合成其野生序列和突變序列，以pmirGLO質粒為載體，分別構建含有MMP-2 3'-UTR和MMP-2 3'-UTR突變序列的質粒，然后與miR-17 mimic或mimic-NC通過Lipfectamine 3000共轉染至HTR8-SVneo細胞，48 h后用熒光檢測儀檢測熒光強度，每組試驗重復3次。

1.9 統計學處理：用SPSS 20.0軟件進行數據分析。實驗數據用均數±標準差表示，兩組均數間比較用t檢驗，多組均數比較采用單因素方差分析和LSD法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 轉染后miR-17的表達情況：熒光定量PCR檢測轉染miR-17 mimic或miR-17 inhibitor后HTR8-SVneo細胞中miR-17水平。結果見圖1，與mimic-NC組相比，miR-17 mimic組中miR-17水平顯著增加，而轉染miR-17 inhibitor顯著下調HTR8-SVneo細胞中miR-17水平，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 轉染后miR-17的表達情況。*P＜0.05

2.2 miR-17對HTR8-SVneo細胞遷移和侵襲的影響：Transwell侵襲實驗結果顯示：轉染miR-17mimic后，HTR8-SVneo細胞侵襲能力顯著下降，而轉染miR-17 inhibitor后細胞侵襲能力較對照組顯著升高（P＜0.05）（圖2）。

細胞劃痕實驗結果顯示：轉染miR-17mimic細胞的遷移能力較對照組顯著降低，而miR-17 inhibitor顯著增加細胞的遷移能力（P＜0.05）（圖2）。

圖2 miR-17對HTR8-SVneo細胞遷移和侵襲的影響。*P＜0.05

2.3 HTR8-SVneo細胞中miR-17調節MMP-2的表達：熒光定量PCR和Western blot檢測miR-17對MMP-2的表達影響。結果顯示，miR-17 mimic顯著降低MMP-2的mRNA水平和蛋白水平，而miR-17 inhibitor顯著提高MMP-2的mRNA水平和蛋白水平（圖3）。經生物在線預測軟件分析顯示，miR-17與MMP-2 3'UTR具有潛在結合位點。為進一步確認miR-17與MMP-2的相互關系，開展雙熒光素酶實驗。結果顯示，miR-17 mimic可降低含有MMP-2 3'UTR序列的熒光素酶報告質粒所在細胞的熒光素酶活性，而對含有MMP-2 3'UTR突變序列的熒光素酶報告質粒所在細胞的熒光素酶活性沒有影響（圖3）。

圖3 miR-17調節MMP-2的表達。*P＜0.05

2.4 MMP-2逆轉miR-17對HTR8-SVneo細胞遷移和侵襲的抑制作用：HTR8-SVneo細胞轉染miR-17 mimic或轉染miR-17 mimic和pcDNAMMP-2組。Transwell侵襲實驗和劃痕實驗結果顯示，miR-17 mimic顯著抑制HTR8-SVneo細胞侵襲和遷移，而pcDNA-MMP-2逆轉miR-17 mimic的抑制作用（圖4）。

3 討 論

胎盤外滋養層細胞向母體子宮組織遷移是胎盤成功植入和胎兒結局的基礎。妊娠早期滋養細胞開始侵襲過程，并持續到妊娠第二十周。在最初的幾周內，遷移到母體螺旋動脈的血管內滋養細胞會堵塞這些血管，這可能會阻止母體血液過早進入絨毛間腔。滋養細胞的異常侵襲、血管的不完全阻塞和氧氣水平的過早升高會損害胎盤絨毛，從而導致妊娠并發癥的發生，如流產、妊娠期高血壓等[6]。最近研究表明，miRNA是滋養細胞侵襲和遷移的一種新的調節因子[7]。有研究報道，人類胎盤中表達大量miRNA，且miRNA表達譜在妊娠高血壓患者和正常人胎盤中存在差異[8]。如Gao等研究發現miR-299通過靶向組蛋白脫乙酰酶2抑制子癇前期滋養細胞的侵襲和遷移。Xu等的實驗發現，與正常對照相比，miR-17在嚴重子癇前期患者胎盤中表達顯著下降[5]。為研究miR-17在滋養層細胞中的作用，在滋養層細胞中促進miR-17表達或抑制miR-17表達，檢測滋養層細胞遷移和侵襲的變化。結果發現，過表達miR-17會抑制HTR8-SVneo細胞遷移和侵襲，揭示miR-17可能在滋養層細胞功能中發揮重要作用。

圖4 MMP-2與miR-17對HTR8-SVneo細胞遷移和侵襲的抑制作用的關系。*P＜0.05；#P＜0.05

近年來研究表明，MMP-2是MMP超家族中一種重要的鋅依賴蛋白酶，可分解細胞外基質復合物，可能參與胚胎發育過程中細胞滋養層的侵襲。MMP-2表達失調和MMP-2活性降低參與了妊娠期高血壓患者子宮胎盤異常重構和滋養細胞侵襲。MMP-2的下調與炎癥和氧化因子共同導致子癇前期滋養細胞功能障礙。研究發現，miR-29b通過靶向MMP-2和血管內皮生長因子A抑制滋養細胞的侵襲和血管生成，增強細胞凋亡。通過生物在線預測軟件及雙熒光素酶報告基因實驗，發現miR-17可抑制MMP-2的表達，且二者存在相互作用。進一步研究發現，MMP-2逆轉miR-17對滋養層細胞遷移和侵襲的抑制作用。

本實驗發現miR-17可抑制HTR8-SVneo細胞的遷移侵襲，進一步研究發現其是通過靶向抑制MMP-2表達，該結果為妊娠高血壓的診治提供新的思路。