不同氮肥水平下春季茶樹新梢代謝組學變化

劉健偉，方寒寒，馬立峰，袁新躍，倪小明

(1.杭州市富陽區農業技術推廣中心，浙江 杭州 311400； 2.中國農業科學院茶葉研究所 農業農村部茶樹生物學與資源利用重點實驗室，浙江 杭州 310008； 3.富陽學院，浙江 杭州 311400； 4.杭州市富陽區食品安全檢驗檢測中心，浙江 杭州 311400)

茶樹主要以新梢采摘，一年有多次采摘和修剪，需要消耗大量營養物質。氮素在茶樹新梢中的含量高達60～70 g·kg-1，1 hm2成齡茶園每年需要300～450 kg的氮肥才可滿足茶樹生長的需要。不同氮肥投入水平會顯著影響茶樹的產量及品質[1]。Ruan等[2]研究發現，不同氮素水平下，茶樹碳氮分配比例存在差異，并且氮素顯著影響茶樹體內的代謝循環，與低氮相比，適氮條件下茶氨酸含量顯著增加，茶多酚含量明顯降低，茶葉品質得到顯著改善。

茶葉的品質代謝物隨季節轉換發生顯著變化，甚至在同一季節的不同時期，綠茶的品質代謝物也會發生深刻的變化，這可能與新梢的生長速率、氣候條件、營養的供應等很多因素有關[3-4]。茶葉品質代謝物的變化除了受氣候條件影響外，還會受到營養器官貯藏的C、N再活化及轉運等因素的影響[5]。Liu等[5]通過評估春季早、中、晚3個時期茶葉初級和次級代謝產物的動態變化，發現春茶后期新梢氨基酸，如茶氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺等氨基酸類物質的含量顯著降低，而黃烷醇、槲皮素及其糖苷含量顯著升高。

代謝組學是系統生物學的一種研究方法，近年來在茶葉方面應用廣泛，主要用于茶葉品質鑒定。Lee等[6]利用代謝組學的方法分析了地理位置與氣候變化對綠茶代謝物的影響，闡明了氣候與代謝產物變化的關系。Pongsuwan等[7]利用超高效液相色譜-串聯四極桿飛行時間質譜(UPLC-Q-TOF/MS)綜合評估了日本綠茶，創建了品質安全模型，發現了眾多與品質有關的生物標志物。景進等[8]收集了我國7個產區50個品種的綠茶樣品，通過代謝組學方法得到綠茶代謝指紋圖譜，初步實現了綠茶品質等級劃分。Lee等[9]利用代謝組學的方法分析了綠茶的營養和感觀品質，總結出了遮光下綠茶的代謝途徑，闡述了遮光與品質的關系。Zhang等[10]利用代謝組學的方法揭示了光敏感性茶樹品種黃金芽在不同光源下黃酮類代謝物的調控機理。本文利用代謝組學技術研究了春季不同氮肥水平下茶樹新梢在不同采摘時期的代謝物變化，旨在為茶樹的高產優質栽培提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗設在中國農業科學院茶葉研究所塑料大棚內進行，茶樹品種為龍井43，于本試驗開始1 a前栽植于營養缽(35 cm×35 cm)中，適時澆水養護，每盆裝土10 kg，定植6株龍井茶苗。

1.2 方法

試驗設3個氮肥用量處理，于2017年2月1日在茶樹根系附近施用：N1，低氮水平，每盆施0.2 g尿素；N2，適氮水平，每盆施2.2 g尿素；N3，高氮水平，每盆施4.8 g尿素。分別于3月25日(T1)、4月1日(T2)、4月6日(T3)進行采樣，采摘標準為一芽二葉。采摘的新梢樣品迅速稱重，液氮中冷卻，然后置于超低溫冰箱(-70 ℃)保存備用。

1.3 基于UPLC-Q-TOF/MS代謝組學的分析

新梢樣品中代謝物提取采用75%甲醇和25%甲酸(FA)混合試劑[11]。提取后的上清液注入UPLC-Q-TOF/MS(Waters，UPLC/Xevo G2-S Q-TOF)，用HSS-T3柱進行分離。首先，每2 h進行1次濾液注射，對該方法的穩定性進行重復測試。穩定后，取樣品進行代謝組學分析。UPLC-Q-TOF/MS正負離子模式下采集數據集，數據集處理采用TransOmics軟件進行，參考文獻[11-12]中的保留時間和質量數鑒定代謝物。參照Liu等[5]分類確定代謝成分。

1.4 數據處理與分析

UPLC-Q-TOF/MS的預處理數據集輸出到SIMCA-P13.0軟件(Umetrics, MKS Instruments Inc., Sweden)進行多變量數據分析。對數據進行Pareto Scaling和可視化，繪制主成分評分，其中每個坐標代表一個單獨的茶葉樣品。

使用SIMCA-P(version 13.0, Umetrics,Umea, Sweden)軟件進行多元統計分析，對于分類和處理進行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)。PCA從宏觀上區分出不同組間代謝物變化的差異程度，OPLS-DA分析不同處理間引起代謝物差異的信息。OPLS-DA模型可獲得代謝物差異數據的VIP值，并作為代謝物選擇的系數，用t檢驗(P<0.05)對代謝物差異的顯著性進行驗證，最后獲得對不同組間差異有重要貢獻的代謝產物。

2 結果與分析

2.1 氮素水平對不同時期茶樹新梢產量及百芽重的影響

如表1所示，在T1時期，隨著氮素的增加，每盆新梢產量顯著增加，百芽重也相應增加，且N3和N1處理的差異達顯著水平；在T2時期，每盆新梢處理以N2處理的最高，顯著高于其他處理，每盆百芽重在不同處理間無顯著差異；在T3時期，3個氮素水平下茶樹新梢產量、百芽重均無顯著變化。

表1 不同施氮水平不同時期茶樹新梢每盆新梢產量及百芽重

注：同列數據后無相同字母的表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 新梢代謝組學分析

通過UPLC-Q-TOF/MS在茶葉新梢中共鑒定出1 710種代謝產物，以TransOmics軟件獲取的數據集為依據進行主成分分析(圖1)。新梢的代謝產物在3個時期能明顯分離。在T1時期，N1、N2、N3處理下的茶樹新梢樣品明顯區分；在T2時期，N2處理的樣品能與N1和N3處理的樣品相區分；在T3時期，3個處理的樣品區分不明顯。與不同氮肥處理相比，不同時期對新梢代謝物的影響更大。

2.3 新梢差異代謝物的變化

通過多次篩選VIP>1、P<0.05的差異代謝物，最終選定部分差異代謝物進行統計分析(表2)。

圖1 不同氮素水平下春季茶樹新梢不同時期代謝物的主成分分析結果

表2 差異代謝物在不同處理不同時期的含量變化

注：鑒定級別Ⅰ的化合物使用質譜信息、保留時間以及標準品鑒定，鑒定級別Ⅱ的化合物運用色譜質譜信息和保留時間鑒定。公式中N1、N2、N3分別代表N1、N2、N3處理下的含量，T1、T2、T3分別代表T1、T2、T3時期的含量。

在T1階段，與N1相比，N3條件下茶氨酸含量上升，沒食子兒茶素、兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯含量下降，而表沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、沒食子兒茶素沒食子酸酯、槲皮素鼠李糖苷、山柰酚葡萄糖苷、山柰酚含量增加。

在T2階段，與N1相比，N3條件下，茶氨酸、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、沒食子兒茶素沒食子酸酯、槲皮素鼠李糖苷、山柰酚葡萄糖苷、山柰酚含量增加，兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯含量下降。

在T3階段，與N1相比，N3條件下，茶氨酸、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、兒茶素沒食子酸酯、槲皮素鼠李糖苷、山柰酚葡萄糖苷含量增加。

與T1階段相比，在T3階段，茶氨酸顯著下降，兒茶素類代謝物，如沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素、兒茶素、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、沒食子兒茶素沒食子酸酯含量顯著上升。

3 討論

氮素是茶樹生長所必需的大量元素，不同氮肥水平、不同施用時間，甚至不同的施肥模式都會影響茶葉的產量和品質[12-15]。春季合理的氮肥施用可以提早茶芽萌發，增加新梢發芽輪次以及嫩度，提高發芽密度，同時合理的氮肥施用可以促進茶樹體內光合產物和含氮化合物積累，增加氨基酸的含量，降低酚類化合物的含量，降低茶葉中酚氨比，從而有效地增加茶葉產量，提高茶葉品質[2,16]。春季不同時期采摘的茶樹新梢，其代謝物也有顯著差異[16]。本試驗通過代謝組學研究了不同氮素供應下不同階段茶樹新梢品質代謝物的動態變化，進一步驗證了先前的部分結果。同時，本研究發現，春季追施氮肥，氮肥施用不足和氮肥施用過量都會影響茶樹的產量和品質，其影響在T1時期最為明顯，增加氮素投入可以顯著提高春季前期茶樹采摘的新梢產量和百芽重。在品質代謝物方面，在T1時期，與N1相比，N3處理下兒茶素類物質(兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯、沒食子兒茶素)減少，氨基酸含量增加；此外，N2條件下，槲皮素鼠李糖苷，山柰酚葡萄糖苷含量與N1相比明顯降低。這些都說明，追施氮肥改善了茶葉品質代謝成分。T2時期，適量的氮素顯著增加了茶樹的產量，但是過量的氮肥并沒有顯著提高茶葉的產量。品質代謝成分方面，N2、N3與N1相比，茶氨酸增加，兒茶素與表兒茶素沒食子酸酯降低，但是代謝物無顯著區分，總體上不同處理間代謝成分差異不大。T3時期，追施的氮肥并沒有顯著提高茶樹產量，與N1處理相比，N3處理的表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、兒茶素沒食子酸酯、槲皮素鼠李糖苷、山柰酚葡萄糖苷含量增加，代謝組學宏觀上無顯著區分。

總體上看，春季追施氮肥主要影響采摘前期(T1)的茶樹，對中后期(T2和T3)影響不大。同時，與階段采摘對新梢品質代謝物的影響相比，春季追施氮肥對新梢品質代謝物的影響較小。有研究利用15N追蹤技術發現，大多數氮素在冬天被茶樹吸收，其中很大一部分儲存在根、莖、成熟葉中，當來年新梢萌發時，75%儲存的氮將在新梢萌發時被重新利用，新梢中氮素約30%來源于新吸收積累，其余70%來自于根、莖、葉等器官的轉運[16-17]。此外，春季追施的氮肥滿足了前期茶樹新梢萌發的需要，后期新梢萌發從土壤中吸收利用氮素較少，而從營養器官利用的活化養分較多[17]，所以春季追施的氮肥并未顯著影響后期茶樹新梢的產量與品質代謝物。

本試驗明確了早春追肥氮素對茶樹不同階段生長的影響。為兼顧茶葉產量和品質，應防止過量施肥，適當提高追肥次數，以提高氮素利用效率，改善后期茶樹新梢品質代謝物。同時建議重視秋季基肥的施用，加強貯藏器官氮素的積累，這也是春茶產量品質調節的重要手段。