山藥糯性基因Waxy的克隆與分析

吳志剛，姜武，魏余煌，陶正明

(1.浙江省亞熱帶作物研究所，浙江 溫州 325005； 2.瑞安市農林局，浙江 瑞安 325200)

植物淀粉中有直鏈淀粉和支鏈淀粉兩種形態，淀粉組成形式的不同直接影響作物的品質，如籽粒中不含直鏈淀粉或直鏈淀粉含量很低的小麥稱為全糯質小麥[1]。在淀粉合成過程中，顆粒結合型淀粉合成酶(granule-bound starch synthase，GBSS)是控制直鏈淀粉合成的關鍵基因，催化產生線狀多聚葡萄糖分子，該基因也稱糯蛋白，由Waxy基因編碼[2]。Waxy基因廣泛存在于大麥、小麥、谷子、玉米等作物中，并已被克隆獲得[3]。

研究表明，作物直鏈淀粉含量在不同品系或種質之間的差異很大程度上受其所攜帶的Waxy等位基因的影響[4]。例如，在水稻Wx基因表達調節規律的研究中發現，水稻直鏈淀粉含量的高低與Wx基因第1內含子的剪接效率關系密切，而Wx基因第1內含子的剪接效率與第1內含子中+1位置的堿基是G還是T有關[5]。山藥是我國重要的旱糧作物，具有很高的營養價值。淀粉是山藥塊莖的重要組成部分，約占其干物質的50%～80%[6]。研究山藥Waxy基因的功能及調控有助于山藥種質資源創新和新品種選育，本研究通過克隆獲得山藥Waxy基因，以期為加快分子標記輔助選育糯性山藥品種提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究中的山藥來源于植物參薯(DioscoreaalataL.)的糯性栽培品系(WCS01)，采自浙江省溫州市文成縣峃口鎮，糯性品質經支鏈淀粉測定，其支鏈淀粉占總淀粉的比例達83%。以植株生長旺盛期新鮮嫩葉作為提取基因組DNA的試材。

TaqDNA聚合酶、LATaqDNA聚合酶、dNTP、pGEM-T載體購自Promega公司；植物基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、pGM-T克隆試劑盒、TOP-10感受態細胞購自TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司。引物由生物工程(上海)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取與Waxy基因克隆

按照試劑盒方法要求，稱取0.2 g山藥葉片，提取純化分離DNA。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其DNA的完整性。

參照NCBI中番茄(NM_001324528.1)、馬鈴薯(NW_006238976.1)、木薯(JF708948.1)以及玉米(HQ423245.1)等物種的Waxy基因cDNA序列及其編碼氨基酸序列的保守區域，應用Primer premier 5.0軟件設計4對引物擴增山藥Waxy核心序列(表1)。反應體系20 μL，其中PremixTaq聚合酶8 μL，4對上下游引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 9 μL。反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共28個循環；最后72 ℃補充延伸10 min，4 ℃保存。擴增產物經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離，PCR產物連接入pGM-T Vector，轉化入大腸埃希菌TOP-10感受態細胞中，隨機挑選陽性克隆菌液送交生物工程(上海)有限公司測序。

表1 本研究中所用的PCR擴增引物

1.2.2 山藥Waxy末端序列的克隆

根據1.2.1節中獲得的Waxy序列，設計10條通用引物序列，并在已知末端設計3條嵌套的反向特異下游引物(表1)。采用交錯式熱不對稱PCR(thermal asymmetric interlaced PCR，TAIL-PCR)的上游隨機簡并引物AD1-10依次與WAXY-S1、WAXY-S2、WAXY-S3配對進行連續3輪的TAIL-PCR擴增。第1輪反應體系為20 μL：PremixTaq聚合酶10 μL，WAXY-S1引物1 μL，AD1-10 4 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 3 μL。反應結束后，將一輪擴增產物稀釋500倍用于WAXY-S2引物和AD1-AD10二輪擴增，體系如上。將二輪擴增產物稀釋500倍用于WAXY-S3引物和AD1-AD10三輪擴增，體系如上。3輪PCR的反應條件見表2。反應結束后將TAIL-PCR產物按照1.2.1節中的方法電泳回收、克隆及測序。

1.2.3 序列拼接及生物信息分析

根據1.2.1和1.2.2節獲得序列，利用sequencher軟件(5.0版)進行拼接，獲得山藥Waxy完整序列。將序列在NCBI中進行Blast搜索比對，確定目的基因。依照西紅柿、馬鈴薯、木薯以及玉米等參考序列對山藥Waxy外顯子進行結構分析。應用Mega(7.0版)軟件對山藥Waxy及其同源性序列進行比對和系統進化分析。

表2 Waxy末端特異引物的TAIL-PCR反應程序

2 結果與分析

2.1 山藥Waxy全長基因的克隆

Waxy基因全長一般為4 000 bp左右，根據NCBI上番茄、馬鈴薯、木薯以及玉米等作物設計4對核心引物(表1)，3組重復的山藥基因組DNA為模板的PCR擴增結果顯示，在約4 000 bp處具有明顯的條帶(圖1)。通過測序并比對，獲得該基因第1～11號外顯子以及翻譯起始點前400 bp的序列。由于末端序列保守性較差，為獲得該基因全部序列，我們進一步利用3條嵌套式引物(表1)，經過連續3輪TAIL-PCR擴增，通過測序獲得序列與上述核心序列進行拼接，獲得山藥Waxy基因序列3 994 bp。該序列經NCBI網站與其他作物同源性在線比對后，具有高度同源性，確定為山藥的Waxy基因。

圖1 山藥Waxy核心序列PCR擴增結果

2.2 山藥Waxy基因的結構特征

以番茄、馬鈴薯、木薯以及玉米的Waxy基因為參考序列進行注釋，結果顯示，山藥Waxy基因全長DNA序列中共含有13個外顯子和12個內含子，整個編碼區1 785 bp。該基因外顯子的長度變化幅度為64～291 bp，內含子的長度變化幅度為72～153 bp(圖2)。外顯子與內含子的剪切都符合GT-AG原則。內含子中(A+T)的量為58.86%～72.64%，(G+C)的量為27.16%～39.87%，(A+T)的量顯著高于(G+C)的量，與非編碼區中較高的(A+T)含量相一致。

圖2 山藥Waxy基因結構特征

2.3 同源性序列比對及系統進化分析

利用山藥Waxy序列在NCBI核酸比對結果顯示，Waxy編碼序列與金縷梅屬(Hamamelis)、銀縷梅屬(Parrotia)植物中的金縷梅(AF248628.1)、北美金縷梅(AF248630.1)、日本金縷梅(AF248626.1)、墨西哥金縷梅(AF248627.1)、銀縷梅(EF456728.1)、白縷梅(EF456727.1)，以及中國蓮(XM 019199716.1、XM 019198814.1、XM 010253872.2、NM 001302856.1、EU938541.1)和美國蓮(EU649747.1)，油棕(XM 010942532.2、XM 010942531.2、XM 019855455.1)等物種的序列具有高度相似性，相似度在85%以上。此外，利用Mega系統進化樹顯示(圖3)，山藥Waxy序列單獨成一支，與油棕親緣關系較近。與其他物種不能歸為一類，親緣關系較遠。

圖3 山藥Waxy序列進化樹分析

3 小結與討論

分析鑒定Waxy基因的組成對作物淀粉品質評價和遺傳改良具有重要意義。在玉米、水稻、高粱、小麥等作物中，Waxy基因已被克隆，部分成果已經被開發出功能性分子標記，用于糯性品種的選育[3]。Hirano等[7]研究表明，水稻中Waxy基因全長5 499 bp，含有13個外顯子和12個內含子。本研究中，我們創新利用PCR和TAIL-PCR相結合的方法獲得山藥Waxy序列3 994 bp，含有13個外顯子和12個內含子，整個編碼區1 785 bp，內含子的長度變化幅度為72～153 bp，與其他物種的Waxy結構類似。進化關系顯示，山藥Waxy基因與蓮、油棕、金縷梅屬和銀縷梅屬植物的同類基因具有高度相似性。

隨著分子標記技術的發展，分子輔助選擇育種對加快育種進程發揮了越來越重要的作用。Waxy基因與直鏈淀粉關系密切，周屹峰等[8]曾采用直鏈淀粉含量Waxy基因功能性標記“484/485”對13份常用秈型保持系進行多態性鑒定，明確這些材料相應分子標記譜帶特性，篩選出具有明顯中等直鏈淀粉含量的PCR圖譜帶型優質保持系。張晶等[9]構建Waxy基因分子檢測的多重PCR體系，鑒定了6個STS標記并用于小麥分子標記輔助選擇，大大提高了選育的效率。我國山藥具有豐富的遺傳多樣性，其淀粉含量變異大[10-11]，因而在山藥Waxy基因鑒定分析基礎上，建立高效的鑒定方法和體系，并應用于山藥育種改良和種質資源快速評價，將具有廣泛的應用前景。