基因組編輯技術及其檢測鑒定方法研究進展

丁霖，彭城，殷海軍，陳笑蕓，徐俊鋒*，李玥瑩*

(1.沈陽師范大學 生命科學學院，遼寧 沈陽 110034； 2.浙江省農業科學院 浙江省植物有害生物防控重點實驗室，浙江 杭州 310021； 3.江蘇明天種業科技股份有限公司，江蘇 南京 210000)

近年來，隨著現代生物技術迅猛發展，基因編輯技術成為全球性研究熱點，并被Science列為2012年度十大科學進展之一[1]，Nature Methods將其評為過去10 a間對生物學研究最有影響力的10項研究方法之一。基因組編輯技術是指對基因組進行定點修飾和改變的技術。這項技術主要利用序列特異性的DNA結合結構域和非特異性的DNA修飾結構域組合而成的序列特異性核酸內切酶切割DNA靶位點，產生DNA雙鏈斷裂，誘導DNA損傷修復，實現對基因組的堿基突變、缺失和基因插入替換等定向改造[2]。這項技術的最大優點在于不改變目標生物基因組整體的穩定性，只在目標位點發生堿基的缺失或插入，實現了單一或多個性狀的消除或獲得[3]。目前，科學家已經利用基因編輯技術培育出大量的動植物。但是對基因編輯個體進行篩選和鑒定的傳統方法和手段比較費時費力，這對將來針對基因編輯技術的特點建立有效、特異的檢測方法，實現對基因編輯產品的有效監測十分不利，所以急需開發快速、靈敏、高通量的基因編輯個體篩選和鑒定方法。本文概述了CRISPR等基因編輯產品篩選和檢測鑒定的幾種方法，為實現對基因編輯產品的有效監測提供技術支撐。

1 基因組編輯技術及其原理

基因組編輯技術是使用序列特異性核酸酶(sequence-specific nucleases, SSNs)進行的，目前包括鋅指核酸酶(Zinc finger nuclease, ZFN)、轉錄激活因子樣效應核酸酶(transcription activator-like effector nucleases, TALEN)系統和成簇的規律間隔短回文重復序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)系統[4]。其主要原理都是通過SSNs特異切割DNA靶位點，產生DNA雙鏈斷裂，誘導DNA的損傷修復機制(包括非同源性末端連接和同源重組修復)，從而實現對基因組的定向編輯。

1.1 ZFNs技術

ZFNs是第一種由人工改造應用的核酸內切酶，ZFN單體由位于C末端的非特異性切割結構域FokⅠ和位于N端的特異性識別DNA的鋅指蛋白結構(Zinc finger protein, ZFP)組成[5]，其中，鋅指蛋白可以識別特異的DNA序列，而Fok Ⅰ則有切割功能域的功能[6]。一個鋅指結構一般包括30個氨基酸，形成2個反向的β折疊片。結合鋅離子的保守氨基酸為2個半胱氨酸殘基和2個組氨酸殘基。1個鋅指結構域可識別9～12 bp的堿基，將多個(通常為3～6個)鋅指結構組合在一起就可以形成1個大的DNA識別區域。將人工構建的鋅指結構與改造后的FokⅠ限制性內切酶融合，就構成了可以對特定的目標序列進行切割的人工核酸酶ZFNs[7-9]。只有2個FokⅠ切割域的二聚化才能切割雙鏈DNA[10]，因此，需要在基因組靶標位點左右兩邊各設計1個ZFN，2個ZFN結合到特定靶點，當識別位點間距為6～8 bp時，FokⅠ域便發生二聚化產生內切酶活性，對目標DNA雙鏈進行切割，從而使雙鏈DNA斷裂，以此來實現基因組編輯[1]。

1.2 TALEN技術

與ZFN相似，TALEN也是一種核酸酶介導的基因組編輯技術，該技術被評為2012年十大科學進展之一。TALEN技術由類轉錄激活因子效應物(transcription activator-like effector, TALE)的DNA結合結構域與非特異性核酸內切酶FokⅠ的切割結構域融合而成。TALEN來源于植物病原菌黃單胞桿菌Xanthomonas[11]。TALEN識別區域是由34個氨基酸組成，其中32個氨基酸都是保守的，只有第12和13位的氨基酸變化較大，這2個氨基酸被稱為雙氨基酸殘基(repeatvarible di-residues, RVDs)，RVD包括NI、HD、NG以及NN，RVD與堿基的對應關系為：NI識別A，NG識別T，NN識別G，HD識別C[12-13]。每個TALE單體只靶向1個核苷酸，在構建TALEN人工酶時需要針對每一個靶位點的上下游各設計1個，當FokⅠ形成二聚體活性結構時就可以對靶位點進行剪切[14]，實現基因組編輯的目的(圖1)。

源于文獻[14]圖1 TALEN的原理

1.3 CRISPR/Cas9技術

CRISPR/Cas系統存在于細菌和古細菌基因組中，是一種規律的成簇間隔短回文重復序列結構。早在1987年，Nakata 等[15]就在大腸埃希菌中發現有29 nt串聯間隔重復序列存在，但在當時研究人員們并不清楚它的功能。直到2002年，科學家們才首次提出了CRISPR概念[16]。2013年，Science將CRISPR作為SSNs技術的新星列入年度十大科學進展[17]。CRISPR由一系列高度保守的重復序列與間隔序列相間排列組成，在CRISPR序列附近存在高度保守的CRISPR相關基因(CRISPR-associated gene,Casgene)，這些基因編碼的蛋白具有核酸酶功能，可以對DNA序列進行特異性切割。根據Cas基因核心元件序列的不同，CRISPR/Cas免疫系統被分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型3種類型，Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR/Cas免疫系統需要多個Cas蛋白形成的復合體切割DNA雙鏈，而Ⅱ型系統只需要1個Cas9蛋白[18]。CRISPR介導的免疫需要2個RNA，分別是反式激活RNA(trans-activating cr RNA, tracr RNA)和CRISPR基因座轉錄出來的pre-cr RNA。當tracrRNA與pre-cr RNA互補配對后，激活RNAase Ⅲ并對pre-cr RNA進行剪切，使之成為成熟的cr RNA[19-20]。成熟的cr RNA與tracr RNA形成向導RNA (single guide RNA, sg RNA)的嵌合RNA分子，sg RNA引導Cas9蛋白在雙鏈DNA的靶位點上，并在原型間隔毗鄰序列(proto-spacer adjacent motif, PAM)的上游3～8 bp 位置對結合的序列進行切割[21-22](圖2)。

圖2 CRISPR/Cas 9的原理

1.4 CRISPR系統改進技術—CRISPR/Cpf1

CRISPR/Cas9系統的發現在基因編輯領域是一項革命性的技術，但是CRISPR/Cas9系統也有不完美之處，研究人員致力于尋找更加完善、操作更加簡單的基因編輯工具酶。2015年，張峰團隊發現了一種新的CRISPR系統——CRISPR/Cpf1，該團隊證實了這項系統可以實現更加簡單、精確的操作[23]。Cpf1存在于新兇手弗朗西斯菌(Francisellanovicida)、氨基酸球菌(Acidaminococcussp)和毛螺科菌(Lachnospiraceaebacterium)中，為CRISPR/Cas家族的二類V型蛋白[24-25]。相較Cas9酶，Cpf1具有一定的優勢，比如：1)Cpf1 蛋白酶比Cas9蛋白酶小，Cpf1更容易進入細胞組織；另外，Cas9的初級產物pre-cr RNA需要與tracrRNA互補配對后，激活RNAase Ⅲ，并對pre-cr RNA進行剪切，使之成熟；而Cpf1只需自身加工pre-cr RNA，不需要tracrRNA的參與[24, 26]。2)在CRISPR/Cas9系統中，需要cr RNA與tracr RNA形成向導RNA，引導Cas9蛋白切割DNA雙鏈，靶定不同的基因需要設計不同的sgRNA；而在CRISPR/Cpf1中，只要Cpf1與成熟crRNA形成嵌合體就可以實現對靶基因的識別和剪切，這樣可以簡化設計步驟，降低實驗成本。3)Cas9是在相同位置同時切割DNA雙鏈，最終形成一個平末端；而Cpf1切割DNA形成會形成一個有5個核苷酸突出的黏性末端，相比較平末端，黏性末端更容易處理，對目的基因的插入更容易控制。4)Cas9剪切位點離PAM序列很近，如果發生NHEJ修復，插入或者缺失容易改變PAM臨近序列，而Cpf1的剪切位點離PAM序列較遠，不會改變PAM臨近序列，使研究人員在DNA的編輯位置上可以有更多的選擇[27]。5)Cas9和Cpf1都是單鏈RNA指導的核酸內切酶，但Cas9只能切割DNA，而Cpf1既可以切割DNA又可以切割RNA。

1.5 3種基因編輯技術的優缺點

作為第1代人工內切核酸酶技術的ZFNs技術和傳統技術比有一定的優勢，但是依舊存在很多缺陷，比如周期長、載體結構復雜、耗時長、費用高等缺點[28]，最主要的是ZFNs技術無法對基因組進行任意編輯，會有脫靶效應，最終會導致細胞毒性。因此，該技術在應用上受到了一定的限制。TALENs技術被稱為第2代人工內切核酸酶技術，與ZFNs技術相比，TALENs脫靶效率低，效率比較高，但該項技術會帶來一定的毒副作用，因為TALENs與靶序列沒有完全配對，會導致基因組中不同位點的非特異性切割，從而擾亂基因組的穩定，發生毒副作用，并且每個堿基都需要1個TALEN識別模塊，所以整個構建過程工作量較大。改造時間長、經濟成本高等缺點阻礙了以上2種核酸酶技術的發展和應用。當第3代CRISPR技術出現后，成本低、操作簡單、效率高、脫靶效率低的優點使其成為當今分子生物學領域最受歡迎的技術之一。

2 CRISPR技術的應用

2.1 CRISPR技術在動物育種中的應用

2013年，CRISPR技術成功地應用在人和小鼠的細胞上，開啟了基因編輯技術的新時代[29-31]。之后廣泛應用在小鼠、大鼠、果蠅、斑馬魚等模式動物的研究中。農業動物包括豬、牛、羊、雞、鴨、兔、犬等都是重要的經濟動物，利用CRISPR技術的單基因、多基因敲除、大片段敲除和調控基因表達等功能來提高農業動物的生產性能，可以大大增加經濟效益。豬藍耳病是養殖業危害最大的傳染病，研究認為，豬藍耳病病毒的受體基因是分化簇163(CD163)，而分化簇1D(CD1D)則是一類抗原遞呈因子。研究人員通過CRISPR技術敲除了CD163和CD1D基因，最后獲得了基因編輯豬，發現它們有良好的抵抗藍耳病的能力[32]。肌肉生長抑制素(MSTN)基因的功能是調控肌肉的生長發育。通過CRISPR技術獲得了敲除MSTN基因的綿羊，發現它們的產肉性能有所提高[33]。牛奶是人類目前消費最多的動物奶，但牛奶與人乳還是存在一定的差異，比如乳鐵蛋白是十分重要的一種蛋白，但在牛奶中的含量只有人乳的十分之一。牛奶含有的令人過敏的乳球蛋白，但在人乳中不含。為了生產更適合人類飲用的人乳化牛奶，中國農業大學戴蘊平團隊利用基因編輯技術培育出了轉人乳鐵蛋白、人乳溶菌酶、牛β-乳球蛋白基因敲除等一系列新型奶牛。農業動物不僅是經濟動物還是理想的生物醫學模型[34]。臨床發現，血管性血友病是因為vWF基因缺陷，周琪領導的團隊利用CRISPR 技術獲得了vWF基因敲除的廣西巴馬小型豬，發現這些小型豬與血友病人相似，同樣患有凝血功能障礙[35]。由此可見，隨著CRISPR技術發展及完善，會有越來越多服務人類的研究成果。

2.2 CRISPR技術在植物育種中的應用

CRISPR技術被開發以來很快應用于人與動物，2013年中國科學院高彩霞實驗室將該技術應用到水稻、小麥中，證明了CRISPR技術可以應用到植物編輯中[28]。水稻中奔達松敏致死基因BEL決定了水稻對苯達松和磺酰脲類除草劑的抗性，通過CRISPR技術獲得的bel突變體對相關除草劑的抗性功能缺失，其中部分純合突變體表現出對除草劑苯達松敏感表型[35]。研究人員針對玉米中植酸合成的關鍵酶基因ZmIPK構建了2個不同位點的CRISPR載體，靶位點1含SacⅠ酶切位點，靶位點2含BamHⅠ酶切位點，測序分析表明發生了不同程度的插入與缺失。除此之外，CRISPR技術還應用在小麥、高粱、甜橙、大豆、煙草等經濟作物[36]，該項技術在作物育種與培育方面起到重要作用。

2.3 CRISPR技術在分子檢測中的應用

2016年張鋒團隊首次描述了一種靶向RNA的CRISPR相關酶——CRISPR/Cas13a (之前稱之為C2c2)。不同于靶向DNA的CRISPR酶，研究人員稱Cas13a不僅可以靶向RNA，還可以靶向DNA，同時還能切割RNA附近的序列，研究者稱之為“附帶切割”。2016年9月，Jennifer等[37]利用Cas13a的這種附帶切割活性檢測RNA。然而，這種方法需要存在幾百萬個RNA分子，因此Cas13a缺乏很多研究和臨床應用所需的靈敏度。2017年4月，張鋒團隊將Cas13a改造成一種快速、廉價和高度靈敏的診斷工具。該團隊將這種新工具稱為“SHERLOCK”，這種工具能夠經設計作為一種基于試紙條的測試方法加以使用，這樣就可以簡單地儲存并且可以廣泛使用。在新的研究中，SHERLOCK的靈敏度增加了一百萬倍。這種CRISPR工具還包括一種RNA報告分子，當該報告分子被切割時，它會發出熒光。當Cas13a檢測到靶RNA序列時，它的附帶切割活性也會切割這種RNA報告分子，從而釋放可檢測到的熒光信號。研究者稱可以利用這種工具輕松高效地檢測任何核酸分子，這種方法有很多應用，比如：在幾小時內檢測病人血液或尿液樣品中的寨卡病毒，區分寨卡病毒的非洲毒株和美洲毒株的基因序列，區分大腸埃希菌等細菌的特定類型，檢測抗生素耐藥性基因，鑒定不含細胞的DNA片段中的致癌性突變[38]。

3 CRISPR基因編輯個體篩選方法

基因編輯技術的核酸酶是有針對性地誘導DNA雙鏈斷裂，而后細胞啟動修復機制。修復后基本上會產生3種結果(圖3)：1)通過NHEJ或同源重組完美修復(HR)(靶向基因仍然不變)，2)用供體模板(HR基因已轉化為模板序列)對HR進行完美修復，3)容易出錯的NHEJ修復(靶向基因已插入或缺失(indel))。完全修復和基因導入策略的(1)和(2)的結果是可預測的，可以使用專門設計的引物和探針進行檢測。與此相反，通過容易出錯的NHEJ修復會產生各種不同形式的突變，包括缺失、插入等結果，這對突變體的檢測仍然是一項技術挑戰[39]。研究人員建立了許多方法檢測CRISPR系統產生的突變體，目前主要的檢測方法有5種。

圖3 細胞修復的結果

3.1 T7核酸內切酶I(T7E1)測定

2009年，Kim等[40]在改進ZFNs技術時，利用人類胚胎腎細胞(HEK293)以趨化因子CCR5為靶標基因，通過插入螢火蟲熒光酶基因破壞CCR5序列，研究人員設計23對ZFNS對CCR5基因的8個位點進行切割，最后用T7E1檢測方法測定，凝膠電泳圖顯示8個位點的CCR5基因均被切割破壞。2011年， Mussolino等[41]在開發新的基因編輯技術TALEN時，同樣利用HEK293細胞，修飾IL2RG和CCR5基因，以T7E1檢測方法，得到了預期結果，2種基因均被修飾。而Cho等[42]在2013年同樣以CCR5基因為靶基因，利用CRISPR技術進行基因修飾，用T7E1測定，在預期的位置得到了DNA條帶，并根據條帶強度可以計算突變頻率。

3.2 聚合酶鏈反應(PCR)測定

因為大部分的缺失突變發生在DSBs位點，稱為突變熱點區域(MHS)，假設引物3’端覆蓋或者部分覆蓋MHS區域，缺失突變體就不會被擴增，只有野生型會被擴增。基于這個理論，2014年，Yu等[43]以定量PCR為基礎，設計2對引物去檢測突變體并計算突變頻率，一對引物設計在MHS外側為Po，而另一對引物在MHS的3’端，稱為引物側翼Pf，這樣Po就可以擴增出缺失突變體，而Pf就可以擴增出野生型。Hua等[44]在2017年以PCR為基礎，通過改變臨界點退火溫度，開發一種新的檢測CRISPR/Cas9產生的突變體的方法—ACT-PCR，對八氫番茄紅素脫氫酶(ospds)、水稻os02g23823、OsMPK2、斑馬魚phn3.1、glycogenin2、per3基因進行檢測，最后證實ACT-PCR可以有效檢測突變體。研究人員發現，ACT-PCR可以檢測到1 pb的突變，而傳統方法T7E1無法檢測到。

3.3 高分辨率熔解(HRM)分析法

Dahlem等[45]在2012年，通過TALENs技術對斑馬魚的基因組進行特定的基因突變，包括golden、ryr3、tbx6、ryr1a基因，TALENs的序列特異性較高但不是很完美。2013年，Bassett等[46]以果蠅的黃色白色基因為靶標基因，通過CRISPR技術進行基因編輯，利用HRM進行檢測，發現CRISPR技術誘導靶基因突變高達80%，并且這種突變會遺傳到下一代；而且HRM檢測靈敏度很高，即使是單堿基缺失，HRM也會檢測到突變體。2014年，Thomas等[47]報道，HRM能檢測到結果最好的片段大小為50 bp左右，而片段大小在100 bp時檢測結果良好。

3.4 實時熒光定量PCR(qPCR)法

本課題組利用傳統的實時熒光定量平臺開發出了一個簡單、高效檢測CRISPR誘導的突變體的新方法。該方法的原理是CRISPR創造的突變一般發生在前間區序列鄰近基序(PAM)5’端第3個堿基處，利用這個規律，開發雙熒光探針，在PCR擴增區域內同時標記2個熒光探針，一個探針處于突變靶點位置檢測靶位點是否發生突變(探針Ⅰ，FAM)，另一個不在突變靶點，用作內參基因來評估整體樣本內的等位基因數量(探針Ⅱ，HEX)，以此來區分突變個體并檢測突變頻率。以基因編輯的水稻為材料，利用該種方法進行檢測，結果表明，這種檢測方法能夠有效區分水稻的野生型、雜合型突變和純合型突變。經過實驗驗證，qPCR法可以在擬南芥、高粱和玉米等不同物種的基因編輯植物中得到有效應用[48]。

3.5 幾種方法的比較

幾種檢測方法的比較結果見表1。有的檢測方法有一定的局限性，比如耗費時間和勞動力，或者需要昂貴的設備[49]。PCR/RE試驗篩選CRISPR誘導的突變體通常是簡單的和敏感的，但是靶序列附近限制酶位點的可用性受到一定的限制。雖然T7E1得到廣泛的使用，適用于任何目標并且可以識別序列和消化不匹配的異源雙鏈DNA，但與PCR/RE相比，這種方法既浪費時間又消耗勞動力[30]。高分辨率熔解(HRM)分析法是基于解鏈溫度的不同而形成不同形態熔解曲線來分析PCR擴增產物有無突變體，此方法可以成功地用于基因突變的篩選，但是所需要的設備費用昂貴[44]。

表1 基因編輯產品檢測方法比較

4 展望

CRISPR/Cas9技術是繼ZFNsTALEN之后的一種高效快捷的基因編輯技術，而且設計簡單、耗時短。因為PAM存在于任何物種中，基本不受物種限制[50]，所以CRISPR/Cas9技術無論在動物還是在植物以及醫學研究領域中都有極大的發展前景。目前，該項技術還存在一些不足，比如脫靶現象、基因突變等非預期效應。脫靶效應是指設計的sgRNA會與非靶點的DNA錯配導致非預期的基因突變，而這種現象會嚴重影響CRISPR技術的應用[51]。所以應用該項技術時，著重考慮CRISPR的脫靶效應顯得尤為重要。為此，研究者們對脫靶現象進行了研究分析，提出了一系列弱化脫靶的策略。影響脫靶效應的因素主要有：1)PAM序列，PAM序列影響CRISPR的DNA切割率，研究表明NGG介導切割率最高，而且增加PAM序列的長度也會提高靶位點的專一性[52]；2)sgRNA序列，改變sgRNA發卡的長度，可以增加與Cas9的結合率[53]，而sgRNA序列的長度對靶序列的專一性也有一定的影響[54]；3)Cas9/sgRNA的濃度，Cas9蛋白和sgRNA濃度高并不能提高靶位點的專一性，相反，Cas/sgRNA復合體濃度高的時候，Cas9的切割率反而降低[55]。針對這些因素，研究者們提出的策略有：1)sgRNA設計與脫靶效應評估軟件，比如CRISPR Design、Cas9 Design、CRISPR-P、CHOOCHOP等軟件可在設計時直接評估脫靶率，以此來提高sgRNA序列設計的特異性[56]。2)雙切口措施，通過改造Cas9蛋白得到其突變型Cas9n切口酶，改造過的CRISPR/Cas9系統，可大幅度降低脫靶效應[57-58]。3)改變sgRNA的序列，通過改變sgRNA的結構和序列長度可以降低脫靶率，比如將sgRNA的序列長度縮短到17～18個核苷酸時，可以大大降低脫靶率[54]。4)控制Cas9/sgRNA的濃度，降低Cas9/sgRNA的復合體濃度，脫靶率也隨之降低，而利用RNA聚合酶Ⅱ轉錄系統可以更好地控制sgRNA的表達量[59]。隨著基因編輯技術的不斷發展，研究者們對CRISPR/Cas9技術不斷地進行優化和完善，以期發揮該項技術的最大用處。

隨著CRISPR技術的廣泛應用，基因編輯產品不斷涌出，針對其產品的檢測與鑒定顯得尤為重要。雖然目前有許多方法可以檢測CRISPR突變體，但這些方法都有相應的缺點。本文對這些方法進行了分析比較，指出現行方法的優缺點，研究人員可以根據自身需要進行選擇，也可以幾種方法相互結合，互相驗證。同時，我們期待研究者能研究出一種耗時短、靈敏度高、成本低的方法，對基因編輯產品進行鑒定檢測。