芥菜種質資源分子聚類分析

宋慧，任錫亮，張香琴

(寧波市農業科學研究院蔬菜研究所 寧波市瓜菜育種重點實驗室,浙江 寧波 315040)

芥菜(Brassicajuncea)是十字花科蕓薹屬草本植物，是全國各地普遍栽培的常用蔬菜，特別是南方地區，芥菜是當地的特色資源和支柱型產業，對增加當地農民的經濟收入有重要作用。同時，我國是芥菜的原產地，擁有1 000多份各具特色的芥菜種質[1]，這為培育豐產優質、成熟期短、抗病蟲、耐逆、適應性強的優質芥菜品種提供了豐富的育種材料[2-3]。旦巴等[4-6]和宋偉林等[7]先后利用隨機擴增多態性DNA(polymerase chain reaction，RAPD)、擴增片段長度多態性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)、簡單重復序列(simple sequence repeats，SSR)和相關序列擴增多態性(sequence—related amplified polymorphism，SRAP)等標記對西藏地區野生芥菜資源進行遺傳多樣性分析，發現西藏特殊的地理環境和復雜的地貌使得當地資源變異豐富，分子聚類結果與種質地理位置密切相關。蒲曉斌等[8]和徐愛遐等[9]對我國西南、西北、西部及北部地區芥菜資源和品種進行資源評估，聚類結果遵循地理和生態環境規律，為芥菜種質資源搜集提供了依據。喬愛民等[10]和陳發波等[11]研究表明，芥菜變種間存在遺傳多樣性，并呈現地域分布規律。

寧波市農業科學研究院自開展芥菜遺傳育種以來，除了搜集江浙一帶農家品種，還引進大量芥菜資源，經過歷年繁育配組，材料品目繁多、來源模糊、表型鑒定工作繁重，極不利于親本選配。曾川等[12]在對三峽庫區芥菜品種聚類分析后，認為試驗材料來源比較狹窄或者模糊的情況下，分子標記能夠更準確地區分材料間遺傳距離。本研究利用分子標記技術對寧波市農業科學研究院芥菜種質資源進行聚類分析，梳理材料間親緣關系，為進一步鑒定和利用種質材料提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

寧波市農業科學研究院蔬菜研究所十字花科課題組保存的41份優質特異芥菜種質資源。

1.2 DNA提取

取芥菜幼葉，利用CTAB法提取DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳和微量核酸濃度測定儀(K5600)檢測DNA濃度和質量，要求電泳條帶清晰無彌散，A260/280為1.7～1.8。

1.3 RAPD和SSR擴增與檢測

RAPD引物參考蒲曉斌等[8]，SSR引物參考巴旦等[6]和陳發波等[11]報道的序列，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。采用康為世紀生物科技有限公司2×TaqMasterMix(Day)PCR混合液，按照說明書調整反應體系為10 μL：5 μL 2×TaqMasterMix(Day)、0.4 μL引物(5 mmol·L-1)、1 μL DNA(10 ng·μL-1)，加ddH2O至10 μL。PCR擴增程序為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，37 ℃(RAPD)/55 ℃(SSR) 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環；72 ℃ 2 min。RAPD和SSR的PCR產物分別用1%普通瓊脂糖凝膠和2%MS-6高分辨率瓊脂糖凝膠(Takara)電泳，凝膠成像系統觀察擴增產物。

1.4 數據分析

根據瓊脂糖凝膠電泳結果，統計條帶清晰、樣品間有多態性的位點，相同遷移位點擴增出條帶的記為“1”，無條帶記為“0”，建立0和1矩陣。計算標記多態信息量，利用NTSYS-pc2.10e軟件處理數據，繪制聚類圖。多態性比例=(多態性位點/擴增位點)×100%。

2 結果與分析

2.1 差異引物的多態性

試驗共使用48個RAPD和98對SSR標記，分別擴增395和462個位點，平均每個引物擴增8.2和4.7個條帶。篩選到8個RAPD和10個SSR差異引物，在41份芥菜種質中擴增出30個多態性位點，2種標記的多態性比例分別為3.04%和3.90%，SSR標記多態性比RAPD的高(表1，圖1)。

表1 RAPD和SSR標記在41份芥菜種質中的多態性

圖1 SSR引物在41份芥菜材料中的擴增

2.2 41份芥菜種質聚類

通過計算41份材料間的遺傳相似系數繪制聚類圖，結果(表2，圖2)表明，材料間遺傳相似系數為0.31～1.00，以0.78為閾值，可以將供試材料分作9種類型。其中，第Ⅲ類包含芥菜種質最多，有16份，第Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ和Ⅷ類分別只包含1份芥菜，其他各類包含2～7個芥菜材料。第Ⅸ類與第Ⅰ類遺傳距離最遠，差別最大；第Ⅸ類中的9號材料與其他各類相似系數均較小(0.56～0.62)，是41份芥菜材料中差異最大的材料，9號與第Ⅰ類37號相似系數最小(0.31)、遺傳距離最大。根據分析結果，可以選擇不同類型、遺傳相似系數小的芥菜相互配組，利用雜種優勢選育品種。

表2 供試41份芥菜種質聚類結果

圖2 41份芥菜種質材料的聚類

3 小結

遺傳多樣性是反映育種材料遺傳變異的重要指標[13]，遺傳多樣性豐富，說明種質類型多樣，遺傳差異較大，在品種選育及改良中有更多可選擇和利用的基因。利用聚類分析明確作物種質資源的遺傳多樣性及其變化趨勢，有助于正確選擇親本，較好地利用種質資源。分子標記技術在芥菜品種親緣關系[14-17]和種質遺傳多樣性[18-19]分析中應用廣泛。陳發波等[11]利用SSR標記檢測到16份芥菜變種間的遺傳相似系數為0.41～0.75，平均值為0.6，說明芥菜變種間存在一定的遺傳多樣性；Qi等[20]利用40對AFLP引物對中國芥菜16個變種的親緣關系進行分析，其遺傳相似系數為0.63～0.88。本試驗利用RAPD和SSR引物檢測到41份芥菜種質間遺傳相似系數為0.31～1.00，材料間遺傳變異較豐富，說明寧波市農業科學研究院近年來搜集引進的芥菜種質差異較大，蘊含豐富的遺傳基因。在實際應用中，4、13、14和28等4份材料，由于收集的時間、地點和獲得途徑不同，雖然外觀表型相似，但不能完全確定是否是同一個材料，對用作親本一直存在疑慮。本實驗將這4份材料聚為一類，有效地解決了這個問題，如此可以避免使用同類材料配組，減少育種消耗。此外，我們選擇14號轉育成的雄性不育系為母本，分別與來自不同類群的8號和11號雜交，育成了甬雪3號[浙(非)審蔬2012008]和甬雪4號[浙(非)審蔬2014002]雪里蕻。這2個品種表現生長勢強、產量高、抗病毒病，雜種優勢非常明顯，顯示了根據聚類結果選配親本的優勢。甬雪3號和甬雪4號雪里蕻雜交新品種的推廣應用，受到了種植基地的歡迎。