熱激下紫花苜蓿兩個品種過氧化物酶活性和同工酶的比較

李夢婷

摘 要：本實驗以秋眠級不同的兩種紫花苜蓿德欽（代號10號）和阿爾岡金（代號11號）為材料，旨在探討紫花苜蓿這個兩個品種在高溫脅迫下的適應情況，并比較其變化程度，為選擇耐熱性強的紫花苜蓿品種提供理論依據，提供一個很好地被植物參考。通過對兩種不同秋眠級紫花苜蓿葉片在不同溫度下過氧化物酶（POD）活性和同工酶的測定，結果表明：過氧化物酶（POD）兩種生理指標的綜合評價下可以分析比較出11號品種比10號品種紫花苜蓿的耐熱性強。實驗結論：在同等高溫脅迫條件下：11號耐熱性強于10號，11號可作為我國南方的推廣和應用的參考材料依據。

關鍵詞：高溫；紫花苜蓿；耐熱性；過氧化物酶

1 前言

紫花苜蓿Medicago sativa是世界廣泛栽培的優質豆科牧草之一， 屬多年生草本植物，是我國草食畜禽和奶牛飼養業的主要飼草， 也是工業飼料的主要原料和改良農業生態環境的優良草種， 在我國牧草產業化和栽培草地建設中占有主要地位[1]，而耐熱性差限制了它在我國南方的推廣和應用，由于紫花苜蓿在日平均氣溫15-21℃ 時生長最好，常溫下生長適宜溫度為20-25℃，紫花苜蓿能夠在白天平均30-35℃的高溫下生長 ，但在生長過程對高溫卻極為敏感，并且在高溫逆境脅迫下，生長著的植物體內會發生一些異常的生理生化反應：首先是代謝速率逆轉、無氧條件下蛋白質降解、生物膜系統結構和功能破壞，最終導致植物死亡[2]。目前人們對苜蓿抗性的研究多集中在抗旱、抗寒、耐鹽堿等方面，對苜蓿熱脅迫反應及抗熱性鑒定研究較少[3]，因此對于紫花苜蓿這種高蛋白質植物來說， 在南方的種植其耐熱性的篩選研究是很重要的。

POD過氧化物酶廣泛存在于植物體中， 是活性較高的一種酶，是酶促活性氧清除系統的主要組成成分，能催化H2O2轉化為H2O，并能分解植物體內某些代謝物需氧脫氫后所產生的有害物質，防止或減輕因有害物質的積累而對植物造成的傷害，因此其活性的高低可以反應植物的代謝狀況和對環境的適應性[4]。因此本實驗采用POD活性的測定及同工酶分析的方法可以定性定量的作為比較兩種紫花苜蓿的評價指標。本研究以秋眠級不同的阿爾剛金2級文中代號為11號和德欽3級（由畢玉芬教授提供）文中代號為10號。紫花苜蓿為材料，研究比較高溫對這兩種秋眠級有差異的紫花苜蓿葉片中的過氧化物酶（POD）活性和同工酶的影響程度，旨在探討不同品種的紫花苜蓿對高溫的適應性，進而能為南方耐熱性強的紫花苜蓿品種選擇提供理論依據。

2 材料與方法

2.1 實驗時間、地點

本研究實驗于2011年7月8日播種，種植于云南農業大學園林園藝學院教學實驗溫室中，室內實驗于2012年11月至2013年3月在云南農業大學動物科學技術學院草業科學實驗室進行。

2.2 實驗材料及儀器

2.2.1 供試材料：阿爾剛金（由百綠集團提供）文中代號為11號和德欽（由畢玉芬教授提供）文中代號為10號。

2.2.2 儀器 ：（1）分光光度計；（2）移液管及容量瓶（3）離心機（12 000r/min）；（4）研缽（5）垂直板電泳裝置（電泳槽，玻璃板，膠條，電泳梳子，制膠架等）；（6）穩流穩壓電泳儀；（7）高速冷凍離心機；（8）電子天平；（9）電冰箱；（10）瓷盤、微量進樣器；（11）電熱恒溫水浴鍋；（12）電爐及試管等；（13）冰袋及量筒（14）離心試管

2.3 實驗方法

2.3.1 實驗材料培育

紫花苜蓿種子經0.2%高錳酸鉀消毒20min后，用蒸餾水洗滌3次，分別種植在育苗盤中（紅壤：泥炭土：細沙：珍珠巖=2：1：1：1）的方式種植于聚乙烯花盆（d=20cm，高25cm，花盆底部有7個出水孔），置于云南農業大學教學溫室，生長條件是自然溫度、每穴精選3粒大小均勻無破損的種子，置于PQX型多段可編程人工氣候培養箱中，溫度為25℃/20℃（白天/黑夜），光周期為14/10 （白天/黑夜）。每48小時澆水一次，以保持土壤濕潤。5個月后移栽到直徑為12cm的花盆內（栽培基質也為土培，紅壤：泥炭土：珍珠巖：蛭石=1：2：1：1），每個盆內種3株。緩苗7天后，置于不同溫度的PQX-1000B型多段可編程人工氣候箱內進行。

2.3.2 實驗設計

將預先培育好的18盆紫花苜蓿材料（每個品種重復6次）生長溫度設置為常溫25℃/20℃（晝夜，熱激處理0d，作為對照），然后設置高溫35℃/30℃（晝夜），光周期均為14/10 （晝夜），相對濕度控制在65%，光照強度設置為為400 μmol m-2 s-1。高溫脅迫持續的時間設為28天，每7天取一次樣，共取五個階段的樣品：即0 d （溫度為25℃/20℃作為參照）， 7， 14， 21，28和35 d（溫度為35℃/30℃高溫），接著取出預先準備好的新鮮材料中已完全張開并且部位相同的葉片作為取樣的葉片，主要用于測定蛋白質含量和干重。

2.3.3 過氧化物酶POD的提取及活性的測定[7]

POD活性以愈創木酚顯色法測定，材料加入反應體系后直接進行測定，在分光光度計上以每分鐘內A470nm變化為一個酶活性單位。

試劑：50mM Tris-HCL（PH=7.0），內含0.1mM EDTA、愈創木酚、酶液、5mM H2O2

POD的提取 ：準確稱取紫花苜蓿10號、11號兩個品種的葉片各0.25g。加適量液氮充分研磨（冰浴），分別加入2ml緩沖液（50mM Tris-HCL，pH7.0），12000r/min，40℃離心20min，取上清液，并量出上清液的體積，用于酶活性的測定。

2.3.4 過氧化物酶POD同工酶的測定方法[8]

POD同工酶技術能準確地表達種間或品種間的親緣關系，已成為植物分類和鑒定研究重要方法，2O世紀7O年代以來，在草業科學領域中廣泛應用于物種、變種和品種的區分鑒定 ，以及苜蓿材料親緣關系、抗逆性、品種鑒定和分類方面[8]。

制備膠前：第一步：配制工作液

A液：丙烯酰胺儲存液，100ml30%（W/V）丙烯酰胺，0.8%雙丙烯酰胺。

方法：30g丙烯酰胺+0.8%雙丙烯酰胺+ddH2O（超純水）定容為100ml。

B液：4X分離膠緩沖液；100ml。

方法：1.5M Tris-HCL（Ph8.8）37.5+12.5水 18.2gTris溶于40ml ddH2O中，加入 HCl3.05ml+ddh2O定容為100ml。

C液：4X堆積膠緩沖液，100ml ；0.5M Tris-HCL（PH6.8）25+25ddH2O

方法：6.0gTris溶于40mlddH2O中，加入HCl4.16ml+ddH2O定容為100ml。

第二步：10%過硫酸銨，5ml

方法：0.5g過硫酸銨+5mlddH2O

第三步：電泳緩沖液，1L

方法：3gTris堿+14.4g甘氨酸+ddH2O定容1000ml（PH8.8）

第四步：5X樣品緩沖液，10ml

方法：3.1ml 1LTris-HCL（PH6.8）

5.0ml 50%（V/V）甘油

1.0ml 1%溴酚藍

1.4ml ddH2O

用微量移液器吸取樣品酶粗液和制備凝膠

10%分離膠：加樣順序為A液3.3ml，B液2.5ml，ddH2O4.2ml，10%過硫酸銨50ul， TEMED5ul，10ml混合均勻，即為10%分離膠溶液。將按上數比例配成的分離膠液倒進已封口的玻璃夾板中。為了防止氣泡產生，用移液槍將配好的分離膠緩慢注入電泳板內，當溶液距離短板1.5cm時停止，用注射器裝水在膠液上表液較注1層（1-5mm）水，用于隔絕空氣，使膠面平整。聚合的最適溫度為25C。當聚合完成時可看到水與凝固的膠棉面有明顯的水膠分界線，用濾紙吸出水層，在用少量濃縮膠緩沖液淋洗分離膠的上腔。等待時間為30-60min。

5%濃縮膠：加樣順序A液0.67ml，C液1.0ml，ddH2O2.3ml，10%過硫酸銨30ulTEMED5ul，4ml混合均勻，即為5%分離膠溶液。倒去聚合分離膠表面的水層，將按上述順序配置好的濃縮膠倒進玻璃夾板中分離膠的上面，如膠高度為距離玻璃板上緣約0.5處，輕輕插入梳子。

加樣

上樣緩沖液按4：1比列混合即20ul+5ul加入每一梳齒。不同樣品之間要防止污染，每空進樣量為18ul。

電泳

電壓200v（保持恒壓，0.75mm的膠，電流開始時為100mA，在電泳結束時為60mA），待溴酚藍移至距玻璃板下端1-5mm處停止電泳。電泳時間為30-40min。

電泳結束后，小心地揭開玻璃板，用注射器沖洗膠的四周，用小刀輕敲玻璃板的邊緣，使凝膠剝離開玻璃板，滑入事先準備好的裝有染液的磁盤中染色。

染色

3%的H202；取10ml的30%H2O2，用ddH2O定容至100ul。聯苯胺醋酸溶液：0.25聯苯胺溶于2.25ml文火加熱的冰醋酸，加入10.25ml的ddH2O。將12.5ml聯苯胺醋酸溶液，5ml3%H2O2混合均勻后用ddH2O定容至250ml，即配成POD染液。將剝離的膠片浸入染色液中5-10min，取出用ddH2O漂洗，停止染色。

2.4 處理軟件

3 次重復所得數據用Excel進行分析。

3 結果與分析

3.1 高溫脅迫處理下2種紫花苜蓿（POD）活性的分析比較

由實驗結果可知，隨著高溫脅迫時間的延長，兩個紫花苜蓿品種的POD活性呈現先降低后升高再降低的變化趨勢。在0天時由于在常溫（25℃/20℃）兩個紫花苜蓿品種的活性達到最大值，11號活性在1600-1800（μg/g.DW.min）之間，10號活性在1400-1600（μg/g.DW.min）之間，它們的活性差值接近200（μg/g.DW.min）；在高溫脅迫（溫度為35℃/30℃）的第7天這個時間段時（轉折期），11號和10號活性相對于0天時都開始下降，且11號和10號將接近重合，活性大約在1000（μg/g.DW.min）處，這個間段的10號和11號的活性差距不明顯；隨后在脅迫的7-4天之間，11號相對于10號還有活性有上升的趨勢，且11號出現脅迫后活性的最大值出現在1000（μg/g.DW.min）處，而10號從轉折點處就一直在下降，11號和10號的活性差值接近300（μg/g.DW.min）；從14-28天這個間段分析，兩個品種的活性出現先下降后上升，但是11號的 POD活性下降的趨勢一直低于10號，它們之間的活性差值也是接近300（μg/g.DW.min）；在第28-35天時，隨脅迫時間的延長，兩個品種都開始下降，11號處理組 POD活性下降程度略顯高于10號組紫花苜蓿。圖1可知受高溫脅迫時11號的活性下降程度要小于10號，也就是說在受到高溫脅迫時11號的抗性表現出比10號強的優勢。

3.2 高溫脅迫處理下2種紫花苜蓿（POD）同工酶的酶譜分析比較

在相同的條件下，對紫花苜蓿兩種材料10號、11號的POD同工酶進行了聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。經比較首先可以看出，兩個品種在0天沒受到脅迫時都可以清楚的數出兩個品種的酶譜數，實驗中能數出11號品種的酶條帶數有9條，10號的有8條。其次從高溫脅迫后11號的酶條帶數比10號的酶條帶數在顏色著色上有明顯差別，11號品種的著色要深的多，并且11號的條帶數要比較清晰，在受到脅迫后，也就是從第7天開始，11號品種酶帶數和0天區別并不是很大，還能清楚的數出條帶數，而10號品種則在第7天時，其酶條帶數就和0天有差異，第3條酶條帶的顏色開始變得比較模糊，顏色比較淺。再次還可以從條帶的寬度上比較出，11號的條帶要比10號的稍微寬一點，同時在橫向上分析它們之間的同工酶譜帶數、酶活性的強弱的差別之中，可以分辨得出它們都有相同的母帶5條，但其中10號的第2條、第7條在受到高溫脅迫后比11號品種同等酶條帶模糊的多，為多態性條帶，活性相應也比較弱。由正級到負級總體上觀察圖片比較可得11號品種出現拖帶的條帶數比10號的要多，因此活性相比10好要強，可見用同工酶分析可比較出11號耐熱性要優于10號品種。

4 討論

4.1 POD是植物體內重要的活性氧清除酶，可以有效地清除活性氧自由基，減少丙二醛的積累，對抵御膜脂過氧化和維護膜結構的完整性具有重要作用。因此本實驗對提高紫花苜蓿的抗逆性有重要的意義。

4.2 廣泛存在于植物體內的過氧化物酶同工酶是植物體適應環境變化并對變化了的環境做出靈敏反應的一類酶，常被認為是植物對逆境環境抗逆作用大小的標志[5]。因此對紫花苜蓿高溫脅迫的耐熱性生理研究受到了廣泛的關注，所以本實驗的研究也因此可以提供一些理論依據。

4.3 正常情況下植物體內的各項代謝及生理生化過程都是比較穩定而協調的，當植物受到逆境的脅迫時，植物體內的各種代謝活動發生變化，植物對逆境做出反映[6]。因此本實驗的的研究也僅僅只是測定紫花苜蓿耐熱性生理指標中的過氧化物酶一方面，對紫花苜蓿的耐熱性的比較研究還需要更進一步加深。

5 結論

實驗中，隨著高溫時間的延長，兩種紫花苜蓿品種的活性都在下降，但11號品種下降的程度小于10號品種，差值在200-300（μg/g.DW.min）。用同工酶分析技術這種方法通過比較同工酶譜條帶數、寬度和清晰程度可以分析出11號的條帶數比10號多一條，酶條帶的清晰程度強于10號，條帶的寬度比10號稍寬。因此結合過氧化物酶（POD）兩種生理指標的綜合評價下可以分析比較出11號品種比10號品種紫花苜蓿的耐熱性強。

參考文獻

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