甘藍型油菜BnEOD3基因克隆與比較測序分析

俎 峰，李 霞，何曉瑩，張國建，張建昆，董云松，王敬喬，束正齊，陳 葦*

(1.云南省農業科學院經濟作物研究所，云南 昆明 650225；2. 云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所，云南 昆明 650205；3. 云南省農業職業技術學院，云南 昆明 650031)

【研究意義】中國是世界上油菜種植與菜籽生產最主要的國家之一，其種植面積和菜籽總產均約占世界的30 %左右，但中國也是主要的菜籽進口國，油菜籽生產自給嚴重不足[1]。因此，大力提升中國油菜籽產量是我國油菜產業未來健康發展的關鍵所在?！厩叭搜芯窟M展】母體遺傳基因EOD3(enhancer of da1) 編碼細胞色素P450/CYP78A6，是重要的調控擬南芥籽粒發育的基因，在植物體絕大部分器官中均有表達。在擬南芥中過表達EOD3基因能夠顯著增加籽粒的大小，相反敲除該基因則會導致籽粒變小。該基因與同一家族基因CYP78A9存在功能冗余，雙基因突變體能夠產生更小的籽粒。遺傳分析還表明EOD3基因與同為母體遺傳的基因DA1與TTG2位于不同的調控路徑[2]?！颈狙芯壳腥朦c】目前尚未有擬南芥EOD3基因的甘藍型油菜同源基因克隆的報道。本研究以甘藍性油菜特大籽粒種質(千粒重千粒重7.0 g左右)與小粒種質(千粒重3.2 g左右)為研究材料，克隆在籽粒發育中表達的BnEOD3基因拷貝，并比較測序分析?！緮M解決的關鍵問題】雖然EOD3基因在擬南芥中是重要的調控籽粒發育的基因，但在甘藍型油菜研究中尚未有該基因被克隆的報道，因此有必要克隆該基因在甘藍型油菜的同源基因，明確該基因在甘藍型油菜籽粒發育中有多少功能拷貝表達，并在大小籽粒材料間進行比較測序分析，以期為該基因的功能分析與后續的分子標記輔助育種奠定數據基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

甘藍型油菜特大籽粒材料C010(千粒重7.0 g左右)與小籽粒材料C008(千粒重3.2 g左右)均由云南省農業科學院經濟作物研究所油菜中心提供。2016年10月種植在小哨油菜基地，2017年2月油菜花期，套袋自交，采集發育中的角果，剝取籽粒用于總RNA的提取。

1.2 實驗方法

1.2.1 本地化數據庫搭建與擬南芥EOD3基因Blast分析 從甘藍型油菜序列數據庫(http://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus)下載甘藍型油菜基因組序列與CDS序列到本地計算機，使用blast+2.7.1軟件包中makeblastdb.exe程序默認參數搭建本地化甘藍型油菜基因組序列與CDS序列Blast分析數據庫。提交擬南芥EOD3基因序列信息(http://www.arabidopsis.org/)到本地化CDS數據庫進行blast分析，參數設置為-task blastn，-num_alignments 1，-outfmt 6，-evalue 0。

1.2.2 RNA提取，引物設計與基因克隆 使用Takara植物總RNA提取試劑盒提取發育中籽?？俁NA。使用Takara反轉錄試劑盒PrimeScriptⅡ 1st Stand cDNA Synthesis Kit 合成第一鏈cDNA，具體操作參見前人報道[3]。提取本地化Blast得到的EOD3基因的甘藍型油菜同源CDS序列，使用SeqMan軟件進行序列比對分析，選擇同源CDS序列中高度保守的序列設計引物。采用高保真Taq酶(Takara)進行cDNA擴增反應，PCR條件為94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min擴增34個循環；72 ℃ 5 min之后再在反應體系中加入普通taq酶72 ℃延伸5 min以便PCR產物末端加A。PCR擴增產物連接到pMD8-T(Takara)載體上，轉化感受態細胞，挑斑檢測。為克隆到盡可能多的BnEOD3基因拷貝，每份材料送20株菌斑液至擎科昆明公司測序。

1.2.3 序列分析 使用MEGA5.2分析軟件對同源拷貝序列與數據庫預測的基因序列進行UPGMA聚類分析，并繪制系統進化樹，用以明確基因拷貝來源。使用GENEDOC軟件繪制序列比較分析圖，用以直觀展示相同來源的基因拷貝在大小籽粒材料間的SNP與氨基酸差異位點。

2 結果與分析

2.1 甘藍型油菜BnEOD3基因存在4個可能的同源基因拷貝

提交擬南芥EOD3基因序列到本地化甘藍型油菜CDS序列數據庫進行Blast分析。結果顯示，共Blast到4個相似度超過85 %的甘藍型油菜同源基因拷貝(BnaC04g00760D，BnaA05g01200D，BnaC04g50960D與BnaA04g27100D)，分別位于甘藍型油菜C04，A05與A04染色體上，其中C04染色體上有2個拷貝(BnaC04g00760D與BnaC04g50960D)。BnaC04g00760D與EOD3序列相似度最高，為87.34 %；Blast得分為1970(表1)。因此，推測甘藍型油菜BnEOD3基因存在4個同源基因拷貝。

2.2 大小籽粒材料發育中籽粒表達的BnEOD3基因克隆與拷貝數及來源分析

使用SeqMan軟件對BnEOD3基因的4個拷貝BnaC04g00760D，BnaA05g01200D，BnaC04g50960D與BnaA04g27100D進行多序列比對分析，選擇一致性序列設計引物(Forward primer，5’-TGGCTACAGAACTCGAAAGC-3’；Reverse primer，5’-TTAAGTACGTCTACGGCGCA-3’)，進行大小籽粒材料BnEOD3基因克隆，挑斑測序分別獲得20條測序結果。其中特大籽粒材料C010得到的20條序列相同，應為同一基因拷貝表達產物，命名為BnEOD3-C010。小籽粒材料C008得到的20條序列中16條序列一致，另外4條序列一致，推測為2個基因拷貝表達產物，分別命名為BnEOD3-C008.1與BnEOD3-C008.2。利用MEGA5.2軟件對BnaC04g00760D，BnaA05g01200D，BnaC04g50960D，BnaA04g27100D與BnEOD3-C010，BnEOD3-C008.1，BnEOD3-C008.2進行序列分析。構建進化樹(圖1)顯示，以上7條序列可以分為2大類，第1類包含BnEOD3-C010，BnEOD3-C008.1，BnaA04g27100D，BnEOD3-C008.2與BnaC04g50960D5條序列；第2類包含BnaC04g00760D與BnaA05g01200D 2條序列。其中第1類中BnEOD3-C010，BnEOD3-C008.1與BnaA04g27100D序列相似度更高，BnEOD3-C008.2與BnaC04g50960D序列相似度更高。推測在大籽粒材料C010發育中籽粒表達的BnEOD3基因拷貝主要為BnaA04g27100D，而在小籽粒材料發育籽粒中表達的則為BnaA04g27100D與BnaC04g50960D2個BnEOD3基因拷貝。BnaC04g00760D與BnaA05g01200D這2個BnEOD3基因拷貝可能均未在發育中籽粒內表達。

表1 甘藍型油菜CDS數據庫EOD基因Blast分析結果Table 1 Blast analysis of EOD3 in the reference CDS in Brasica napus

圖1 BnEOD3基因諸多拷貝序列相似性分析Fig.1 Analysis of sequence similarity among copys of BnEOD3 gene

BnEOD3-C010: BnEOD3基因拷貝BnaA04g27100D在大籽粒材料C010中的擴增序列；BnEOD3-C008.1: BnEOD3基因拷貝BnaA04g27100D在小籽粒材料C008中的擴增序列，下同；黑色箭頭所示為差異SNP位點BnEOD3-C010 and BnEOD3-C008.1 were the BnaA04g27100D sequence expressed in C010 and C008, respectively. The same as below. The black arrow showed the SNP site圖2 BnEOD3-C010與BnEOD3-C008.1 cDNA序列比較分析Fig.2 Comparative analysis between BnEOD3-C010 and BnEOD3-C008.1 cDNA sequences

黑色箭頭所示為差異氨基酸位點The black arrow showed the difference site between the two sequences圖3 BnEOD3-C010與BnEOD3-C008.1蛋白質序列比較分析Fig.3 Comparative analysis between BnEOD3-C010 and BnEOD3-C008.1 protein sequences

2.3 BnEOD3-C010與BnEOD3-C008.1 SNP分析與編碼氨基酸序列差異分析

進一步比較分析BnaA04g27100D在大小籽粒材料表達的序列BnEOD3-C010與BnEOD3-C008.1發現，2條序列僅在第114堿基處存在SNP變異(C010為C，C008為G，圖2)，此位點的差異導致甘氨酸(G)與丙氨酸(A)的氨基酸序列的差異(圖3)。而甘氨酸(G)與丙氨酸(A)同為疏水性氨基酸，具有一定的功能替代性，因此該位點變異是否會導致功能變異還需要進一步研究。

3 討 論

近20年來中國冬油菜產量分析表明，千粒重作為油菜產量的重要構成因素之一，是今后一段時間內油菜遺傳改良的重點[4]。國內外科學家對甘藍型油菜千粒重性狀進行了廣泛的研究，已累計在甘藍型油菜19條連鎖群上檢測到超過100個與千粒重相關的QTL位點[5-9]，但至今僅有1個基因-BnARF18被圖位克隆到[6]。而同為十字花科植物的擬南芥，則已經識別并克隆到了近百個調控籽粒大小發育的基因[10-13]。鑒于擬南芥與油菜基因在功能上存在良好保守性[14-15]，因此借鑒擬南芥籽粒大小發育相關基因功能研究信息克隆同源的油菜基因，有助于加快甘藍型油菜籽粒發育調控分子機制的研究，對于研究甘藍型油菜千粒重性狀是有一定意義的。

特大籽粒甘藍型油菜種質材料為云南省農科院經濟作物研究所油菜育種團隊通過三交種F1小孢子培養種質創新所得，在武漢及昆明兩地多年多點田間種植千粒重均穩定在7.0 g 左右[16-18]，具有良好的生產應用前景。同時，該種質材料與普通小籽粒材料正反交F1代籽粒差異顯著(數據未發表)，表明C010特大籽粒性狀遺傳具有母體效應特征。目前擬南芥中研究報道的母體遺傳基因有DA1[19-20]，TTG2[21]，AP2[22]與EOD3[2]等基因。其中EOD3作為重要的調控擬南芥籽粒發育的基因[2]，在甘藍型油菜研究中尚未有基因克隆的報道。因此有必要采用基因克隆技術克隆該基因在甘藍型油菜的同源基因，進而明確該基因在籽粒發育中有多少功能拷貝表達，并通過在大小籽粒材料間進行比較測序分析，以期為該基因的功能分析與后續的分子標記輔助育種奠定數據基礎。本研究發現EOD3基因在甘藍型油菜基因組中有4個拷貝，分別為BnaC04g00760D，BnaA05g01200D，BnaC04g50960D，BnaA04g27100D。其中BnaA04g2 7100D在大小籽粒材料發育籽粒中均有表達，BnaC04g50960D僅在小籽粒發育籽粒中檢測到。這一差異是否與籽粒大小表型差異有關尚不可知，需要進一步研究。同時本次實驗中未檢測到BnaC04g00760D與BnaA05g01200D的表達。推測BnaC04g00760D與BnaA05g01200D拷貝可能為進化過程中產生的假基因或功能分化后不再在籽粒中表達。進一步比較分析BnaA04g27100D在大小籽粒材料表達的序列發現，2條序列僅在該拷貝第114堿基處存在SNP變異(C010為C，C008為G，圖2)，此位點的差異導致甘氨酸(G)與丙氨酸(A)的氨基酸序列的差異(圖3)，不過二者同為疏水性氨基酸，具有一定的功能替代性，因此該位點變異是否會導致功能變異還需要進一步研究。

4 結 論

本研究發現EOD3基因在甘藍型油菜中存在4個拷貝(BnaC04g00760D，BnaA05g01200D，BnaC04g50960D，BnaA04g27100D)。其中BnaA04g27100D在大小籽粒材料發育籽粒中均有表達，BnaC04g50960D僅在小籽粒材料發育籽粒中檢測到，未檢測到BnaC04g00760D與BnaA05g01200D在籽粒中的表達。大小籽粒材料BnaA04g27100D間在第114堿基處存在SNP變異(C010為C，C008為G，圖2)，此位點的差異導致氨基酸序列甘氨酸(G)與丙氨酸(A)的氨基酸的差異。