耐寒和非耐寒橡膠樹幼苗葉片抗氧化及抗壞血酸-谷胱甘肽循環對低溫脅迫的反應差異

孔廣紅,郭建春,劉 姣,姚 遠,李瑞梅,柳 覲,李國華，和麗崗,胡新文

(1.海南大學熱帶農林學院,海南 ?？?570228；2.中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所，海南 ?？?571101；3.云南省熱帶作物科學研究所,云南 景洪 666100)

【研究意義】橡膠樹 (Heveabrasiliensis) 系大戟科(Euphobiaceae)三葉橡膠樹屬(Hevea)，原產于南美洲北緯 5° 至南緯 15°、西經 48° 至 78° 亞馬遜河流域的巴西、秘魯、哥倫比亞、委內瑞拉和圭亞那等國[1]。南北緯 10° 的熱帶地區是橡膠樹的傳統種植區[2], 中國的植膠區分布于北緯 18°至 24°的熱帶北緣地區(主要是海南、云南和廣東)，屬于非傳統植膠區[3]?！厩叭搜芯窟M展】橡膠樹在生長發育過程中，低溫寒害是經常面對的非生物脅迫，且幾乎每年都會發生，嚴重影響橡膠樹的經濟壽命及橡膠單產[4]。低溫寒害是制約我國橡膠產業發展的最主要的環境限制因子[5]。植物遭遇非生物脅迫時其耐受力會提高是與植物增加營養吸收、改變體內激素平衡、增強活性氧清除系統活性和滲透調節物的合成有關[6]。通常情況下，植物體內活性氧的產生和清除處于動態平衡狀態，當植物遭受逆境時，代謝平衡被打破，產生大量的活性氧自由基，使得膜系統的完整性降低，電解質及有機小分子物質外滲，導致一系列生理生化代謝紊亂[7]?！颈狙芯壳腥朦c】關于橡膠樹對低溫脅迫的生理響應已有眾多報道，大多集中于低溫脅迫對某些生理生化指標的影響[8]，以此研究橡膠樹的抗寒性生理機制，但是低溫脅迫下橡膠樹不同耐寒性品種間其酶促反應和非酶促反應的差異尚未見報道。【擬解決關鍵問題】選擇耐寒和非耐寒 2 個橡膠樹無性系，研究耐寒和非耐寒無性系橡膠樹幼苗在低溫逆境下葉片抗氧化系統及抗壞血酸-谷胱甘肽循環的反應差異，探索低溫控制橡膠樹幼苗的生理響應機制，為橡膠樹耐寒性種質資源篩選以及后續開展以低溫脅迫系統關鍵基因改良橡膠樹種質資源提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以耐寒橡膠樹無性系 ‘云研 77-4’ 和非耐寒無性系 ‘熱墾 501’ 為供試材料。品種 ‘云研 77-4’ 是云南省熱帶作物科學研究所選育出的抗寒、高產、速生、副性狀良好的自主品種，親本為 ‘GT1’ × ‘PR 107’[9]。品種 ‘熱墾 501’ 是引進的低溫敏感種質材料，來自 ‘RRIM600’× ‘PB260’ 雜交組合[10]。2 個品種的壓條均取自云南省熱帶作物科學研究所的橡膠樹增殖圃，以橡膠樹品種 ‘GT1’ 的實生苗為砧木。2017年11月進行芽接，待接穗成活后，鋸掉樹樁，使接穗快速生長，按照橡膠樹栽培管理技術規程進行撫育管理，當無性系幼苗長至2蓬葉穩定期時，開展相關試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 處理溫度的設置 橡膠樹生長的最適溫度條件為年平均溫度(28±2) ℃, 晝夜溫差約7 ℃[11]。相關研究表明橡膠樹抗寒性強的品種低溫半致死溫度在-4～0 ℃， 抗寒性弱的品種低溫半致死溫度在4～7 ℃[12]。因此設置橡膠樹生長的最適溫度 28 ℃/ 28 ℃(晝/夜)為對照處理溫度，4 ℃/ 4 ℃(晝/夜)為低溫脅迫溫度。

1.2.2 試驗設計 選取長勢一致的 2 蓬葉穩定期幼苗作為試驗材料，2 個無性系在對照溫度(28 ℃)和低溫脅迫溫度(4 ℃)下各處理1、12、24 h，試驗共計 12 個處理，每處理 3 次重復，以 5 株幼苗為一重復。試驗材料放置于人工氣候室進行處理，人工氣候室的光照設置為白天(光照) 12 h、夜間(黑暗) 12 h，相對濕度 70 % 左右。各處理均取第 2 蓬葉片進行生理指標測定，采集樣品用液氮速凍后保存于-80 ℃ 超低溫冰箱，試驗材料處理完成后集中測定各項生理指標。

1.2.3 生理生化指標的測定 采用南京建成生物工程研究所研制的試劑盒測定過氧化氫(Hydrogen peroxide, H2O2)含量、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活性、過氧化氫酶(Catalase，CAT)活性、過氧化物酶(Peroxidase，POD)活性、谷胱甘肽(Glutathione, GSH)含量、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase, GSH-PX)活性、抗壞血酸(Ascorbic acid, AsA)含量，操作步驟按使用說明書進行。

1.2.4 數據處理 試驗數據的統計和分析采用 SPSS 20.0 軟件及LSD多重比較(P<0.05)，圖表繪制采用 Microsoft Excel 2010軟件。

2 結果與分析

2.1 低溫脅迫對橡膠樹幼苗抗氧化系統的影響

2.1.1 低溫脅迫對橡膠樹葉片 H2O2含量的影響 由圖 1 可知，隨著處理時間的延長，低溫處理(4 ℃)與對照(28 ℃)相比，2 個橡膠樹無性系幼苗葉片 H2O2含量均呈現降低-升高-降低的趨勢；‘熱墾 501’ 的 6 個處理差異不顯著；‘云研 77-4’ 在處理 1和 12 h 時低溫脅迫與對照相比差異顯著。處理 1 h后， 28 ℃ 條件下 ‘云研 77-4’ 幼苗葉片的 H2O2含量最高，與 ‘熱墾 501’ 相比差異不顯著，顯著高于 4 ℃ 處理下 ‘云研 77-4’ 和 ‘熱墾 501’ 的 H2O2含量。處理 12 h后，4 ℃ 低溫條件下 ‘云研 77-4’ 幼苗葉片的 H2O2含量最高，顯著高于自身對照，與非耐寒無性系 ‘熱墾 501’ 28 ℃ 及 4 ℃ 處理相比差異達顯著水平?！疅釅?501’ H2O2含量在 28 ℃ 及 4 ℃ 處理之間含量上升，但差異不顯著。處理 24 h 后，2 個無性系的低溫處理與對照相比，H2O2含量均有所下降，但差異未達顯著水平。結果表明低溫脅迫處理后非耐寒無性系 ‘熱墾 501’ 幼苗葉片中 H2O2含量變化不大，‘云研 77-4’ 則隨低溫處理時間延長顯著上升或者顯著下降，說明在低溫的刺激下，耐寒性無性系 ‘云研 77-4’ 對低溫逆境快速做出反應，以抵御不良環境對其造成的影響，同時內源 H2O2脈沖式的產生，將有助于耐寒無性系 ‘云研 77-4’ 增強酶和非酶系統的活性。

2.1.2 低溫脅迫對橡膠樹葉片抗氧化酶活性的影響 圖 2-A 是低溫脅迫下 SOD 酶活性變化圖，隨著低溫處理時間的延長，‘云研 77-4’ 的 SOD 活性產生了顯著變化，4 ℃ 低溫處理 12 h 后達到最大值，顯著高于1和 24 h ，以 12 h 作為拐點形成急劇上升和急劇下降的趨勢，3 個時間點中低溫處理的酶活力與對照酶活力相比呈現降低-升高-降低的變化趨勢。‘熱墾 501’ 在各個時間點酶活力的表達也呈現降低-升高-降低的變化趨勢，但只是緩慢的起伏，差異未達顯著水平。4 ℃ 條件下，處理 1 h 時，‘云研 77-4’ 與 ‘熱墾 501’ SOD 活力在同一水平；處理 12 h ，‘云研 77-4’ SOD 活力顯著高于 ‘熱墾 501’；處理 24 h，‘云研 77-4’ 與 ‘熱墾 501’ SOD 活力又回落至 1 h 時的水平。

由圖2-B 可見，處理 1 h后，耐寒無性系 ‘云研 77-4’ 和非耐寒無性系 ‘熱墾 501’ 在 4 ℃ 低溫脅迫下 POD 活力均低于對照溫度(28 ℃)處理條件下的 POD 活力，但 ‘云研 77-4’ POD 活力與對照相比顯著下降，說明 ‘云研 77-4’POD 活力下降的幅度大于 ‘熱墾 501’。處理 12 h 后，低溫條件下 ‘熱墾 501’POD 活力與自身對照相比變化不大，‘云研 77-4’ POD 活力與自身對照相比顯著升高。處理 24 h 后， 2 個無性系 4 ℃ 低溫處理的 POD 活力與對照相比均有所下降，但下降幅度差異未達顯著水平。隨著低溫處理時間的延長，‘云研 77-4’ 在低溫處理 12 h 后 POD 活力顯著高于 1和 24 h；‘熱墾 501’ 在低溫處理 12 h 后 POD 活力高于1 24 h，它們之間差異不顯著。‘云研 77-4’ 的 POD 活力在低溫處理 1，12，24 h 時均高于 ‘熱墾 501’。3 個時間點 2 個無性系低溫處理的酶活力與自身對照酶活力相比均呈現降低-升高-降低的趨勢。

不同小寫字母表示在 0.05 水平上差異顯著。下同Different lowercase letters indicated significance at 0.05 level. The same as below圖1 低溫脅迫對橡膠樹葉片 H2O2 含量的影響Fig.1 Effects of low temperature stress on the H2O2 content in rubber tree seedlings’ leaves

圖 2-C 顯示低溫脅迫下 CAT 活性的變化趨勢。CAT 活力變化趨勢與 SOD、POD 的變化趨勢一致。在4 ℃ 低溫條件下， ‘熱墾 501’ 的酶活力與自身對照相比呈現降低-升高-降低的變化趨勢，各處理之間差異未達顯著性水平；‘云研 77-4’ 同樣呈現降低-升高-降低的趨勢，在 1和 12 h 時低溫處理和對照之間差異達顯著性水平；處理1、24 h 時，‘云研 77-4’ 的 CAT 活力高于 ‘熱墾 501’，處理 12 h ，‘云研 77-4’CAT 活力顯著高于 ‘熱墾 501’。說明在遭遇低溫脅迫時 ‘云研 77-4’ CAT 活力比 ‘熱墾 501’ 高，也能迅速的對低溫產生響應。

綜上所述，在最適生長條件下，抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活力保持穩定水平，24 h 內晝夜節律對它的影響不大；遭遇低溫時，耐寒無性系調節抗氧化酶活力的能力強于非耐寒無性系，進一步證明耐寒無性系通過提高酶活性抵御過多 ROS 對機體的傷害，從而提高耐寒性。

2.2 低溫脅迫對橡膠樹幼苗抗壞血酸-谷胱甘肽循環的影響

2.2.1 低溫脅迫對橡膠樹幼苗抗壞血酸(AsA)含量的影響 由圖 3 可知，對照和低溫處理條件下，3 個時間點中，‘云研 77-4’ 抗壞血酸含量(AsA)均顯著高于 ‘熱墾 501’。隨著低溫處理時間的延長，‘熱墾 501’ AsA 含量與 ‘云研 77-4’ 相比一直處于比較低的狀態，在 4 ℃ 低溫條件下不同時間點有一個小幅度的波動，但差異未達顯著水平，呈現低-高-低的趨勢?！蒲?77-4’ AsA 含量低溫處理1 h時顯著低于自身對照，12 h 時顯著高于自身對照，也顯著高于 1和24，24 h 時低于自身對照。由此可見抗壞血酸(AsA)可以作為衡量橡膠樹耐寒性的一項重要生理指標。

A：低溫脅迫下 SOD 酶活的變化；B：低溫脅迫下 POD 酶活的變化；C：低溫脅迫下 CAT 酶活的變化A: Changes of SOD activity under low temperature; B: Changes of POD activity under and low temperature; C: Changes of CAT activity under low temperature圖2 低溫脅迫對橡膠樹幼苗葉片抗氧化酶活性的影響Fig.2 Effects of low temperature stress on the activity of antioxidant enzymes in rubber tree seedlings’ leaves

圖3 低溫脅迫對橡膠樹幼苗 AsA 含量的影響Fig.3 Effects of low temperature stress on the AsA content in rubber tree seedlings’ leaves

2.2.2 低溫脅迫對橡膠樹幼苗谷胱甘肽(GSH)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活性的影響 圖 4-A 可見，對照溫度(28 ℃)條件下，耐寒無性系 ‘云研 77-4’ 和非耐寒無性系 ‘熱墾 501’GSH 含量均比較穩定。處理溫度(4 ℃)條件下，‘云研 77-4’ GSH 的含量于處理 1和24 h 時高于 ‘熱墾 501’，差異未達顯著水平，處理12 h 時顯著高于 ‘熱墾 501’。與自身對照相比，2 個無性系在 3 個時間點的GSH 含量均呈現降低-升高-降低的趨勢。隨著低溫處理時間延長，2 個無性系同樣呈現低-高-低的趨勢。由此可知 12 h是 GSH 含量變化的一個拐點時間，GSH 的含量出現周期震蕩。

由圖 4-B 可見，處理 1 h 后，2 個無性系在低溫脅迫下 GSH-PX 活力分別與各自對照相比變化不大，但 ‘云研 77-4’ 的酶活力在 28和 4 ℃ 條件下均顯著低于 ‘熱墾 501’。處理 12 h 后，低溫脅迫下 ‘熱墾 501’ 的 GSH-PX 活力與自身對照相比顯著下降；‘云研 77-4’ 的酶活力與對照相比稍微提高，但增加的幅度很小；在 28 ℃ 條件下 ‘云研 77-4’ 的酶活力顯著低于 ‘熱墾 501’，在 4 ℃ 條件下，‘云研 77-4’ 的酶活力低于 ‘熱墾 501’，差異不顯著。處理 24 h 后，4 ℃ 條件下 2 個無性系的 GSH-PX 活力均強于各自對照；‘云研 77-4’的酶活力在 2 個溫度條件下均低于 ‘熱墾 501’。隨著處理時間的延長，‘云研 77-4’GSH-PX 活力與自身對照比較，呈現下降-上升-上升的趨勢；‘熱墾 501’ 呈現上升-下降-上升的趨勢。GSH-PX 是機體內廣泛存在的一種重要的催化 H2O2分解的酶，它以 GSH 為底物特異的催化反應，可以保護細胞膜結構和功能的完整，所以出現了 2 個無性系的 GSH-PX 活力與 GSH 含量的變化趨勢呈現相反的趨勢，即在同一時間點 GSH-PX 酶活力高時 GSH 含量低，GSH-PX 酶活力低時 GSH 含量高。

A：低溫脅迫下 GSH 含量的變化；B：低溫脅迫下 GSH-PX 酶活的變化A: Changes of GSH content under low temperature; B: Changes of GSH-PX activity under and low temperature圖4 低溫脅迫對橡膠樹幼苗葉片 GSH 和 GSH-PX 的影響Fig.4 Effects of low temperature stress on the GSH content and activity of GSH-PX in rubber tree seedlings’ leaves

3 討 論

自然環境中存在晝夜溫差，即使在晝夜溫度波動較大的情況下，晝夜節律在一定溫度范圍內保持相對恒定，即晝夜節律的溫度補償效應[19]。本研究顯示，耐寒無性系 ‘云研 77-4’ 和非耐寒無性系 ‘熱墾 501’ 在晝夜溫度為 28 ℃/28 ℃的處理條件下，3 個時間點中各項生理指標均處于相對穩定水平，說明適于橡膠樹生長的溫度條件下，晝夜節律對 2 個橡膠樹品系的抗氧化酶活性及抗壞血酸-谷胱甘肽循環影響不大，驗證了晝夜節律的溫度補償效應。在遭受非生物脅迫時，植物為了自我保護以便能更好的適應環境變化，晝夜節律也會隨之發生變化[20]。本研究顯示，隨著低溫脅迫時間的延長，2 個橡膠樹無性系的抗氧化酶活性及抗壞血酸-谷胱甘肽循環均呈現較大的變異，差異達到顯著性水平，且 2 個無性系的變化均以 12 h 為拐點，說明耐寒性不同的橡膠樹幼苗對低溫脅迫產生不同的響應機制。

4 結 論

研究顯示耐寒和非耐寒無性系橡膠樹葉片抗氧化和抗壞血酸-谷胱甘肽循環系統在低溫脅迫下的反應差異，表明葉片抗氧化及抗壞血酸-谷胱甘肽循環系統與橡膠樹幼苗耐寒性密切相關，為橡膠樹耐寒性種質資源篩選以及后續開展以低溫脅迫和晝夜節律系統關鍵基因改良橡膠樹種質資源提供理論依據。