土壤細菌群落對濕熱滅菌蠶沙還田的響應

王 謝，鄧虎軍，林超文，姚 莉，唐 甜，張建華*

(1.四川省農業科學院土壤肥料研究所，四川 成都 610066； 2.農業農村部西南山地農業環境重點實驗室，四川 成都 610066；3.郫都區環境保護局，四川 成都 611730)

【研究意義】蠶沙是由蠶糞、殘留的桑葉和蠶的脫皮等所組成，其中，蠶糞含氮量很高，尤以可溶性尿酸的含量最為豐富；殘桑含有大量的蛋白質、纖維素、糖類和磷脂等，可溶糖高達4.72 %；蠶脫皮主要由蛋白質所組成[1]。因其富含有機質和礦質養分，被認為是生物有機肥的重要原料[2]，但蠶沙攜帶有大量致病性很強的病源微生物[3]，嚴重地威脅到家蠶的養殖和生產，因而蠶沙的無害化處理被認為是蠶沙綜合利用的一個關鍵課題。為了抑制蠶的腸道微生物對蠶沙養分在外界環境中的有害自然發酵，減少蠶沙養分的消耗，防止還有微生物生長分泌有毒副作用物質，控制蠶病病原微生物的擴散，可利用物理或化學的方法殺死或除去蠶沙物料中一切有生物物質，其中濕熱滅菌技術為常用的滅菌方法。【前人研究進展】濕熱滅菌法是指利用飽和蒸汽進行滅菌的方法。由于蒸汽具有很強的穿透能力，在冷凝時會釋放大量的冷凝熱，可使得生物體內一些重要的蛋白質，如酶類，發生凝固、形變，導致微生物無法生存而死亡[4]。當前，蠶沙還田的研究主要針對堆肥處理的蠶沙[5]，對于濕熱滅菌無害化處理的蠶沙研究上屬于空白。【本研究切入點】本文研究濕熱滅菌蠶沙還田對該部分研究作為適當的補充。土壤微生物是土壤生態系統物質循環和能量交換的重要樞紐,是衡量植被恢復效益好壞的敏感指標，能較早地指示土壤生態系統功能的變化[6]。鑒于蠶沙本身對土壤所具有的潛在培肥能力，本研究希望在排除自身攜帶外源微生物條件下。【擬解決的關鍵問題】明確土壤細菌群落結構對于蠶沙養分資源的快速響應狀況，以揭示土壤微生物對蠶沙還田的協同響應狀況，為蠶區土壤生態系統功能穩定性的維持提供科學的參考依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試驗設計

1.1.1 供試土壤 供試土壤為過2 mm篩的風干土，土壤類型為紅棕紫泥土，采至四川省資陽市雁江區坡耕地，土壤采集地無養蠶歷史。土壤的pH平均值為8.8，有機質平均含量16.52 g/kg，全氮平均含量1.22 g/kg，堿解氮平均含量77.11 mg/kg，有效磷平均含量18.11 mg/kg，速效鉀平均含量177.00 mg/kg，陽離子交換量23.77cmol(+)/kg。

1.1.2 供試蠶沙 供試蠶沙為無菌蠶沙，即利用手提式高壓滅菌鍋將有菌蠶沙在121 ℃下濕熱處理5 h后得到無菌蠶沙。其中，有菌蠶沙為2016年春蠶養殖后曬干的干蠶糞，來自四川省樂山市井研縣，以烘干基計算，該蠶沙含有機質65.02 %、氮1.54 %、五氧化二磷0.41 %和氧化鉀2.89 %。

1.1.3 試驗設計 室內恒溫培養試驗設置2個處理：①供試土壤(CK，對照組)，不加蠶糞；②供試土壤+無菌蠶沙(SS，處理組)；各處理重復9次。實驗時取滅菌的玻璃杯(高度13 cm，體積310 mL)，先杯子底部放入1 cm厚濕熱滅菌的棉花，再稱取150 g供試土壤，然后根據處理加入3 g供試蠶糞，再然后用無菌注射器加入50 mL無菌水，然后用保鮮膜封住杯口，并在保鮮膜上用注射器針頭均勻扎扎50個小孔，最后置于光照恒溫培養箱中培養30 d，培養時模擬白日溫度28 ℃、光照時間12 h，模擬黑夜溫度24 ℃、光照時間12 h。為保證培養條件一致，每天早上8點加水5 mL。

1.2 16s DNA測序與物種注釋

1.2.1 DNA提取及測序 準確稱取0.1 g土樣，采用MoBio試劑盒法，提取土樣的總DNA。經1 %瓊脂糖凝膠電泳測定DNA完整性、MiniDorp測定DNA純度和濃度。將9份重復樣分為3組，每組3份。從每組的3份樣品中取等量樣品混勻，于-20 ℃保存、備用。對照組的3個重復分別命名為CK1、CK2和CK3；處理組的3個重復分別命名為SS1、SS2和SS3。參考Caporaso等[7]的方法，通過細菌16S rDNA V4區段引物來擴增各樣品，其引物為515F(5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)。DNA擴增條件為98 ℃預變性1min，98 ℃變性10 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，30個循環，72 ℃延伸5 min[8]。使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構建，構建好的文庫經過Qubit和Q-PCR定量，文庫合格后，使用HiSeq2500 PE250進行上機測序。

1.2.2 物種注釋 準確稱取將所測得原始序列截去Barcode序列和引物序列，利用FLASH(V1.2.7)拼接[9]獲得原始Tags數據；利用Qiime(V1.7.0)軟件[10]過濾處理原始Tags數據獲得高質量的Tags數據，并與Gold database數據庫進行比對，檢測并去除其中的嵌合體序列[11]，獲得有效數據。測序深度為每個文庫原始reaSS數不少于4萬條，以97 %相似性為依據，利用UPARS Epipeline軟件將各序列聚類成為可執行的分類操作單位(Operational taxonomic units，OTUs)。

1.2.3 物種多樣性統計 為獲得土壤樣品中微生物物種的多樣性信息，用Mothur方法與SILVA(http://www.arb-silva.de/)的SSUrRNA數據庫進行物種注釋分析(設定閾值為0.8～1.0)，統計界、門、綱、目、科、屬和種7個分類水平上的樣本的群落組成。使用PyNAST(V1.2)軟件與GreenGene數據庫中的 "Core Set" 數據信息進行快速多序列比對，得到所有OTUs代表序列的系統發生關系。

1.3 統計分析

1.3.1 α多樣性指數計算 使用Qiime(V1.7.0)軟件計算土壤樣本微生物群落α多樣性的相關指數，用Chao I指數和ACD指數表征菌群豐度，用Shannon多樣性指數和Simpson多樣性指數表征菌群多樣性，并利用R軟件對α多樣性指數進行事后檢驗。

1.3.2 群落結構差異性分析 為揭示組件微生物群落結構差異，并指明分類水平下組間的差異物種，首先利用R軟件做組間差異的多響應排列分析[12](Multi Response Permutation Procedure of Within- versus Among-Group Dissimilarities，MRPP分析)；其次，利用R軟件用于進行組間的T-test檢驗，找出差異顯著(P<0.05)的物種；最后，采用組間群落差異分析[13](LDA Effect Size，LEfSe分析)方法，尋找處理組之間具有統計學差異的Biomarker，并根據每個組分(物種)豐度對差異效果影響的大小(即為 LDA Score)繪制 LDA值分布柱狀圖，以展示了LDA Score大于4的物種。

2 結果與分析

2.1 濕熱滅菌蠶沙還田對土壤OUT數目的影響

由圖1可知，SS和CK兩者共有的OTU為2427個，具有差異OUT為1623個。在差異的OTU中，60.26 %為CK獨有，39.74 %為SS獨有。從SS下的土壤微生物的OUT只有CK的90.22 %可知，濕熱滅菌蠶沙還田后會使得土壤細菌的種類減少。

2.2 濕熱滅菌蠶沙還田對土壤細菌群落α多樣性的影響

從圖2可知，CK和SS稀釋曲線最終均趨于平緩，表明本次測序量已基本覆蓋個樣品中的大多數細菌類群。SS中發現物種數目、Chao I指數和ACE指數分別為1801.50±19.09，1989.90±146.29和2058.92±133.9，分別只有CK的75.55 %、72.66 % 和75.4 %。SS處理下土壤細菌群落的Shannon多樣性指數和Simpson多樣性指數為8.16±0.17和0.9875±0.0049。由此可知，蠶糞丟棄物會降低土壤細菌群落的α多樣性。

CK：對照組；SS：處理組CK: Control group; SS: Treatment group圖1 OUTs韋恩圖Fig.1 OUTs venn diagram

CK：對照組；SS：處理組CK: Control group; SS: Treatment group圖2 樣品稀釋曲線圖Fig.2 Rarefaction curves of samples

Wilcox秩和檢驗結果表示，CK和SS之間的Chao I指數、Shannon多樣性指數和Simpson多樣性指數存在顯著的差異，其中，P值分別為0.047、0.030和0.033(P<0.05)。這表明濕熱滅菌蠶沙還田可以顯著地改變土壤細菌群落的α多樣性。

2.3 濕熱滅菌蠶沙還田對土壤細菌群落結構及優勢細菌類群的影響

由表1可知，SS與CK之間的組間差異大于組內差異(A>0)，這表明濕熱滅菌蠶沙還田對土壤細菌結構具有一定的影響，但這種影響尚不顯著(表1，P=0.1)。

在門水平上，SS中相對豐富度排名前10的依次分別為變形菌門(46.38 %±6.09 %)、放線菌門(15.46 %±5.78 %)、擬桿菌門(14.51 %±1.27 %)、厚壁菌門(12.10 %±8.16 %)、酸桿菌門(3.39 %±1.68 %)、疣微菌門(2.14 %±0.66 %)、藍菌門(1.71 %±1.08 %)、芽單胞菌門(1.11 %±0.43 %)、浮霉菌門(1.03 %±0.08 %)和綠彎菌門(0.63 %±0.46 %)，其細菌的相對豐度分別是CK的0.94、2.53、1.33、5.04、0.29、0.57、2.51、0.20、0.45和0.31倍。

在綱水平上，SS中相對豐富度排名前10的依次分別為α-變形菌綱(18.57 %±7.37 %)、未鑒定的放線菌綱(13.91 %±4.47 %)、γ-變形菌綱(12.96 %±1.82 %)、β-變形菌綱(11.54 %±2.25 %)、鞘脂桿菌綱(8.37 %±2.11 %)、梭菌綱(6.56 %±5.70 %)、芽孢桿菌綱(4.26 %±2.50 %)、δ-變形菌綱(2.99 %±1.20 %)、未鑒定的酸桿菌綱(2.77 %±4.39 %)和未鑒定的芽單胞菌綱(1.11 %±1.61 %)，其細菌的相對豐度分別是CK的1.56、3.45、0.98、0.67、1.50、6.99、3.28、0.44、0.28和0.20倍。

表1 MRPP分析Table 1 Results of MRPP analysis

在目水平上，SS中相對豐富度排名前10的依次分別為黃色單胞菌目(9.98 %±2.10 %)、鞘脂桿菌目(8.37 %±2.11 %)、鏈霉菌目(8.29 %±4.77 %)、伯克氏菌目(7.83 %±2.48 %)、梭菌目(6.56 %±5.69 %)、根瘤菌目(5.230 %±1.03 %)、柄桿菌目(4.79 %±2.95 %)、紅螺菌目(4.32 %±3.04 %)、鞘脂單胞菌目(3.16 %±1.73 %)和Subgroup 6(1.27 %±2.97 %)，其細菌的相對豐度分別是CK的0.93、1.50、16.53、0.61、7.00、1.88、2.87、1.94、0.69和0.21倍。

在科水平上，SS中相對豐富度排名前10的依次分別為鏈霉菌科(8.29 %±4.77 %)、黃色單胞菌科(7.23 %±2.00 %)、噬幾丁質菌科(6.25 %±1.87 %)、柄桿菌科(4.77 %±2.98 %)、叢毛單胞菌科(4.13 %±2.80 %)、紅螺菌科(3.00 %±2.85 %)、鞘脂單胞菌科(3.00 %±1.58 %)、毛螺菌科(2.70 %±2.49 %)、梭菌科(2.28 %±2.44 %)和芽單胞菌科(0.82 %±1.20 %)，其細菌的相對豐度分別是CK的16.63、0.87、1.51、3.15、0.46、2.86、0.72、13.08、6.80和0.21倍。

在屬水平上，SS中相對豐富度排名前10的依次分別為鏈霉菌屬(8.18 %±4.75 %)、短波單胞菌屬(3.58 %±2.58 %)、溶桿菌屬(3.54 %±2.20 %)、Flavisolibacter(1.81 %±0.68 %)、固氮螺菌屬(1.65 %±1.93 %)、珊瑚放線菌屬(1.24 %±0.23 %)、新鞘氨醇桿菌屬(0.69 %±0.21 %)、絲桿菌屬(0.63 %±0.18 %)、寡養單胞菌屬(0.57 %±0.26 %)和纖維微菌屬(0.27 %±0.07 %)，其細菌的相對豐度分別是CK的17.83、4.26、0.53、1.24、7.31、4.54、1.35、2.05、1.20和1.57倍。

對比SS和CK從門到屬5個等級的分類水平上細菌類群相對豐度排名前10的差異，不難發現，濕熱滅菌的蠶沙還田會影響土壤的優勢種群。

2.4 處理組與對照組之間組間差異物種分析

組間的T-test檢驗結果表明，在門水平有2個類群的細菌存在顯著差異(P<0.05)，在綱水平有10個類群的細菌存在顯著差異(P<0.05)，在目水平有16個類群的細菌存在顯著差異(P<0.05)，在科水平有43個類群的細菌存在顯著差異(P<0.05)，在屬水平有46個類群的細菌存在顯著差異(P<0.05)，在種水平有14個類群的細菌存在顯著差異(P<0.05)。在種水平上，SS中較CK的顯著增加細菌物種有10種(P<0.05)，分別為Shimazuellasp. 3-435、膠質類芽孢桿菌(Paenibacillusmucilaginosus)、黃色氫噬胞菌(Hydrogenophagaintermedia)、Chitinophagafiliformis、噬菌蛭弧菌(Bdellovibriobacteriovorus)、Shinellakummerowiae、黃褐粘球菌(Myxococcusfulvus)、Paenibacillusprovencensis和星形諾卡菌(Nocardiaasteroides)，其相對豐度較CK增加倍數分別為11.63、9.00、7.33、6.90、6.61、3.31、2.94和1.87。而SS較CK顯著減少的細菌物種有5種(P<0.05)，分別為GemmatimonadetesbacteriumLX87、uncultivated soil bacterium clone C002、AcidobacteriabacteriumWWH111、BacteriumWX65、Jahnellathaxteri，其相對豐度僅為CK的31.25 %、14.29 %、12.50 %、11.76 %和11.11 %。

2.5 濕熱滅菌蠶沙還田后土壤中的潛在生物標記物

LEfSe分析結果(圖3)顯示，CK的特征細菌類群以酸桿菌門和芽單胞菌門為代表，而SS的特征細菌類群以放線菌、厚壁菌門和擬桿菌門為代表。其中，在綱水平上潛在指示濕熱滅菌蠶沙還田的標記菌有未鑒定放線菌綱、梭菌綱、鞘脂桿菌綱、芽孢桿菌綱和黃桿菌綱5類；在目水平上潛在指示濕熱滅菌蠶沙還田的標記菌有鏈霉菌目、梭菌目、芽孢桿菌目、鞘脂桿菌目、根瘤菌目和黃桿菌目6類；在科水平上潛在指示濕熱滅菌蠶沙還田的標記菌有鏈霉菌科、毛螺旋菌科和噬幾丁質菌科3類；在屬水平上潛在指示濕熱滅菌蠶沙還田的標記菌有鏈霉菌屬、短波單胞菌屬和假黃單胞菌屬3類。從CK土壤的潛在生物標記物中可以發現：濕熱滅菌蠶沙還田對土壤原有的噬纖維菌科、芽單胞菌科和叢毛單胞菌科3類細菌具有一定的抑制作用。

3 討 論

3.1 濕熱滅菌蠶沙還田后參與纖維素降解的主要細菌類群

濕熱滅菌蠶沙還田對土壤細菌結構無顯著的影響這一結果暗示了測試土壤的微生物群落結構和功能的穩定性，并彰顯出了其自修復能力。蠶沙濕熱滅菌后還田會向土壤中帶入了大量的未分解和半分解的纖維素，故而濕熱滅菌蠶沙還田后土壤細菌群落表現出的主要功能傾向為纖維素降解。本研究結果顯示，濕熱滅菌蠶沙還田后土壤厚壁菌門和放線菌門細菌分別增加了5.04和2.5倍，而這兩大類細菌都是在纖維素降解中占據優勢地位的細菌類群[14-16]。其中，厚壁菌門的梭菌目和放線菌門的鏈霉菌目最具代表性，本研究中濕熱滅菌蠶沙還田后梭菌目和鏈霉菌目細菌分別增加了7.00和16.53倍、梭菌科和鏈霉菌科細菌分別增加了6.80和16.63倍、鏈霉菌屬細菌增加了17.83倍；梭菌目下毛螺菌科細菌增加了13.08倍。

CK：對照組；SS：處理組CK: Control group; SS: Treatment group圖3 樣品中潛在生物標記物分析(LDA>4)Fig.3 Analysis of potential biomarkers in samples (LDA>4)

厚壁菌門下毛螺菌科的細菌主要來源于動物的腸道[17-19]，高鳳芹在研究兩種馴化瘤胃液的細菌物種多樣性時指出毛螺菌科細菌的增多可能有利于纖維素降解[20]。此外，厚壁菌綱下芽孢桿菌目也是一個不容忽略的重要細菌類群，不論從基礎研究還是應用開發都有很多的報道[21]。李康寧在研究渾善達克沙地生物土壤結皮纖維素降解細菌菌群時利用選擇性培養基篩選出的16株纖維素降解細菌中芽孢桿菌屬和鏈霉菌屬相對豐度分別為43.8 %和25 %，為優勢菌屬[22]。本研究也發現SS處理的土壤中在厚壁菌綱下芽孢桿菌目下的Shimazuellasp. 3-435、膠質類芽孢桿菌(P.mucilaginosus)和P.provencensis比CK增加了11.63、9.00和2.94倍。劉欣利用木聚糖為唯一碳源篩選出一類芽孢桿菌(Paenibacillussp. E18)，經底物特異性分析表明其對樺木木聚糖、大麥葡聚糖、地衣多糖、昆布多糖等具有較好的水解能力[23]。而與之相關的β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21;β-D-glucosidase)水解纖維二糖中的p-1,4-糖苷鍵，直接影響著纖維素的降解效率[24]。鑒于木聚糖是半纖維素中的代表性組分，是自然界中含量僅次于纖維素的第二豐富的多聚糖[22]。認為類芽孢桿菌屬的膠質類芽孢桿菌(P.mucilaginosus)和P.provencensis細菌在濕熱滅菌蠶沙的降解中具有不可或缺的重要作用。

放線菌門下鏈霉菌科細菌作為典型的好氧纖維素降解菌，可通過分泌游離的纖維素酶協同降解纖維素[25]，在纖維素的降解功能上已經十分明確[26-28]，本研究結果也與之相吻合，故此不再重復。

除了厚壁菌門和放線菌門外，變形菌門細菌在纖維素降解中也具有重要的作用。首先，在變形菌門下，本研究就發現短波單胞桿菌屬和固氮螺旋菌屬細菌增加了4.26和7.31倍，它們分屬于α-變形菌綱下的柄桿菌科和紅螺菌科；就短波單胞桿菌而言，它密切參與著纖維素的降解工作，羅立津等[29]在研究耐低溫木質纖維素降解菌群時就支出該菌為25 ℃培養條件下的優勢種群；而就固氮菌而言，蒲一濤等[30]就指出固氮菌和纖維素分解軍的混合培養可以加速生活垃圾的降解。其次，S.kummerowiae增加了3.31倍，它屬于β變形菌綱下紅環菌目、紅環菌科、Shinella屬，屬于Shinella根瘤菌家族成員；這暗示了濕熱滅菌蠶沙還田后在纖維素降解過程中會增加土壤部分有益微生物菌群，促進礦質養分的釋放[31]。再則，本研究結果還顯示假黃單胞菌屬可作為濕熱滅菌蠶沙還田后的潛在生物標記物，而該菌在分類地位上也屬于變形菌門，從屬于γ-變形菌綱下的黃單胞菌科[32]，已經被證明在在降解木質纖維素上具有很高的研究和應用價值[33-34]。

上述纖維素降解的優勢菌群基本與當前的研究結果相一致。除此之外，本研究還發現擬桿菌門下鞘脂桿菌綱下泉發菌科噬幾丁質菌屬下C.filiformis顯著增加了6.90倍，但目前對于該菌的生態功能研究相對較少，無所比較，鑒于幾丁質本分就是β-1,4糖苷鍵連接的線性同源多聚體[35]，屬于土壤碳循環的重要部分[36]，故而本研究猜測該菌的存在可輔助纖維素降解。

3.2 濕熱滅菌蠶沙還田后噬菌蛭弧菌顯著增加

本研究中SS處理條件下噬菌蛭弧菌(B.bacteriovorus)的相對豐度較CK增加了6.61倍；該菌也屬于變形菌門，從屬于δ-變形菌綱、蛭弧菌目、蛭弧菌科、蛭弧菌屬，是1962年Stolp和Petzold等在土壤樣品中發現的一類細菌的寄生菌，它廣泛存在于自然環境中[37]，如植物根際、河流、海洋、污水、腸和鳥類和哺乳動物糞便，甚至在牡蠣和螃蟹的鰓中[38]。而最重要的一點是該菌被認為可能是環境自然凈化的因素之一[37]。噬菌蛭弧菌雖然不能利用碳水化合物，但它以不完全的三羧酸循環為主要代謝途徑，可以利用多肽及氨基酸作為能源和碳源，具有極強的蛋白質分解能力[39]。由于該菌對人體沒有危害，它不僅被用于污水處理，還被用于生物防治一些農作物的病原菌[38]。

3.3 蠶沙濕熱滅菌后依然存在的環境安全風險

本研究還發現放線菌亞綱下棒桿菌亞目下諾卡氏菌科的星形諾卡菌(N.asteroides)比CK增加了1.87倍。該菌廣泛分布于土壤等自然環境中，為腐物寄生菌，能引起人或動物急性或慢性諾卡菌病[40]。苑美玉指出該菌可通過呼吸道引起人的原發性、化膿性肺部感染，出現肺結核的癥狀[41]。雖然該菌在蠶病中未見報道，但在浮游生物、甲殼類動物、濾食性貝類、海龜蛋和魚類中皆有發現[42-44]，故而建議加強養蠶環境條件下星形諾卡菌(N.asteroides)的研究，并適當考慮在未來養蠶環境安全評估中將星形諾卡菌(N.asteroides)的相對豐度作為評估指標之一。

4 結 論

土壤細菌群落的結構和功能相對穩定，濕熱滅菌蠶沙還田后會快速激活了與纖維素代謝相關的細菌類群，并通過增加這些細菌類群相對豐度的方式促進土壤的自我修復。此外，噬菌蛭弧菌相對豐度的增加進一步暗示了土壤的自凈能力。