漫談硝化作用

陳秋霜 俞如旺

(福建師范大學生命科學學院 福州 350117)

硝化作用是硝化微生物將氨氧化為硝酸的過程，在生物圈氮素循環中占關鍵地位。硝化作用分為自養硝化作用和異養硝化作用，自養硝化作用又包括經典硝化作用和單步硝化作用。

1 經典硝化作用

1890年，俄國微生物學家維諾格拉斯基首次發現并提出硝化作用，它相比于單步硝化作用提出的時間早一個多世紀，因此稱為經典硝化作用，包括兩個階段——氨氧化(亞硝化)和亞硝酸鹽氧化(硝化)。

1.1 氨氧化作用 氨氧化作用(亞硝化作用)是指氨氧化細菌(Ammonia-oxidizing bacteria, AOB)在有氧條件下將氨氧化為亞硝酸，并釋放化學能的過程。該階段的化學反應式為：

氨氧化作用包括由中間產物羥氨(NH2OH)聯系的兩個環節(圖1)。底物氨在氨單加氧酶(AMO)的催化下氧化成羥氨，羥氨在羥氨氧化還原酶(HAO)的催化下氧化形成終產物亞硝酸。

圖1 氨氧化作用機制[1]

介導氨氧化作用的AOB歸屬于硝化桿菌科的5個屬。其中，亞硝化葉菌屬(Nitrosolobus)、亞硝化螺菌屬(Nitrosospira)、亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)和亞硝化弧菌屬(Nitrosovibrio)歸屬于β-變形菌亞綱，亞硝化球菌屬(Nitrosococcus)歸屬于γ-變形菌亞綱。

1.2 亞硝酸鹽氧化作用 亞硝酸鹽氧化作用(硝酸化作用)是指亞硝酸鹽氧化細菌(Nitrite-oxidizing bacteria, NOB)在有氧條件下將亞硝酸氧化為硝酸，并釋放化學能的過程。該階段的化學反應式為：

亞硝酸鹽氧化作用需要亞硝酸鹽氧化還原酶(NXR)的催化。NXR屬于可溶性酶，位于細胞膜靠內的一側，由三個不同亞基(NxrA、 NxrB、 NxrC)構成，各亞基的Mr依次為： 116×103、 65×103和32×103。 NXR具有多重功能，不僅能催化亞硝酸鹽的氧化，還能催化硝酸鹽的還原，因為它兼具氧化亞硝酸鹽和還原硝酸鹽的功能性亞基。意味著NXR能根據氧化還原反應的電勢決定工作方向，且差異的外界環境能誘導NXR發揮不同功能，引發菌株進入不同代謝途徑，如缺氧條件下將硝酸鹽還原。

介導亞硝酸鹽氧化作用的NOB歸屬于硝化桿菌科的4個屬。其中，硝化桿菌屬(Nitrobacter)和硝化球菌屬(Nitrococcus)歸屬于γ-變形菌亞綱，硝化刺菌屬(Nitrsopina)歸屬于β-變形菌亞綱，硝化螺菌屬(Nitrospira)歸屬于硝化螺菌門。

AOB和NOB總稱為硝化細菌。根據AOB和NOB的16S rRNA序列進化關系，兩菌群間除硝化球菌屬與亞硝化球菌屬親緣關系較近外，其他菌種均屬不同綱或不同門，親緣關系甚遠。因此，雖然AOB與NOB在自然界中協同共生，但不存在進化關系上的必然性。

2 單步硝化作用

自1890年來，很多研究均表明硝化作用須嚴格分步進行。1999年，我國學者鄭平等提出不同觀點，認為硝化作用底物含能量不高，理論上應更有利于支持單種微生物生長，而非支持兩種微生物生長[3]。2006年，Costa等根據理想狀態下的動力學理論，認為將氨單步氧化為硝酸鹽的過程是可行的，且在熱力學層面上更易實現。因為比起經典硝化作用，單步完成的硝化作用代謝過程更短，產能效率更高[4]。Costa等預測了全程硝化微生物的存在，并提出了四種可能獲得全程硝化微生物的培養方法。雖然只是設想，但為后續單步硝化作用和全程硝化微生物的發現和培養提供了新思路。

2015年12月，三個科研團隊相繼發現了3種經過純化培養的細菌和1種未經純化培養的細菌具有單獨將氨轉化為硝態氮的能力[5]。科學家將具有單步硝化作用的細菌命名為COMAMMOX (complete ammonia oxidizers)，意為“全程氨氧化微生物”。Van Kessel等[6]對銨廢水進行研究，發現硝化螺菌屬的2個種(CandidatusNitrospiranitrosa及C.N.nitrificans)都具有編碼AMO和HAO的全套基因以及NXR的亞基。隨后，熒光原位雜交放射自顯影技術直接表明上述兩種微生物具有全程氨氧化能力。Daims等在石油勘探井的熱水管壁上獲得了一種具有全程氨氧化能力的嗜熱細菌，因其近似于硝化螺菌屬，故命名“C.N.ino-pinata”[7]。Pinto等在飲用水系統中發現一種類似硝化螺菌屬的細菌具備包括AMO和HAO編碼基因在內的全套氨氧化基因[8]。

3 異養硝化作用

異養硝化微生物種類繁多，分布廣泛。細菌(如產堿桿菌、脫氮副球菌)、真菌、放線菌、甚至藻類等多種異養硝化微生物分布在深海、污泥、土壤和火山口等多種生境中。其中，真菌的數量最大、硝化效率最高。部分異養硝化微生物與硝化細菌有相似的酶系統，兩者都具有關鍵酶AMO和HAO，但兩者的AMO和HAO在組成、結構和對底物敏感度等特性上差異較大。例如，研究者從兩種異養硝化微生物(Arthrobacterglobiformis、Pseudomonassp.)中獲取了部分純化的HAO，發現其為單體蛋白，而硝化細菌的HAO為三聚體蛋白。異養硝化微生物在數量、生長速率和對環境適應性上遠高于硝化細菌。因此，它在某些環境中對硝化作用的貢獻相當于硝化細菌，甚至超過。例如，大量數據表明酸性土壤中硝化作用的主導者是異養微生物。

異養硝化作用機理的研究較為困難，已有的研究成果僅限于個別菌株。主要原因包括反應底物廣譜性、異養硝化微生物多樣性、不同微生物具有的關鍵酶及其編碼基因差異性等。

4 硝化作用對生物圈的影響

氮素循環是生物圈中基本的物質循環之一，循環過程伴隨能量轉換，維持生物發育和生態平衡。氮素循環過程包含8類反應(圖2)： ①生物固氮作用；②硝化作用；③硝酸鹽同化作用；④氨化作用；⑤銨鹽同化作用；⑥異化性硝酸鹽還原作用；⑦反硝化作用；⑧亞硝酸氧化作用。

圖2 生物圈中的氮素循環[9]

在全球范圍內，硝化作用每年將30億噸氨轉化為硝酸鹽(地球上所有植物每年吸收300億噸二氧化碳)，是氮素循環中不可或缺的環節。硝化作用的終產物是硝酸鹽同化作用、異化性硝酸鹽還原作用和反硝化作用的原料。硝化作用的不正常運行可能導致氮素循環中斷，生態系統瓦解。

氮素是合成植物體內許多重要有機物的原料。硝化作用產生的硝酸鹽是植物的主要無機氮肥。因此，土壤中硝化細菌數量和硝化作用強弱是判斷土壤肥力的指標之一。然而，雖然土壤中的硝酸鹽有利于植物生長發育，但其水溶性強，易隨水淋失。隨著農業氮肥推廣使用，土壤中硝酸鹽含量顯著升高，大量氮素隨水淋失進入地下水，成為潛在污染源，危害人體健康，如引起“高鐵血紅蛋白病”等。因此，我國規定飲用水中硝酸鹽含量的限值為10mg/L。不僅如此，水體中硝酸鹽含量過高將引起水體富營養化，導致“赤潮”“水華”等嚴重污染事件發生。

(基金項目： 教育部人文社會科學研究規劃基金項目“核心素養導向的科學課程高中學業水平考試實施策略與命題研究”,No.17YJA880088,*通信作者)