內源性和外源性植物乳桿菌發酵對梨汁品質的影響

盧嘉懿，李汴生,2*，阮征

1(華南理工大學 食品科學與工程學院，廣東 廣州，510640)2(廣東省天然產物綠色加工與產品安全重點實驗室，廣東 廣州，510640)

發酵是最早、最傳統的加工和保存果蔬的生物手段，利用乳酸菌發酵是其中一種重要的方式。乳酸發酵方式中，從傳統的自然(自發)發酵到添加發酵劑(發酵菌種)發酵，都有各自的優勢與缺陷。自然發酵制品中的復雜菌群有利于豐富風味，但因微生物安全性等原因難以控制產品品質。而成量的、占優勢的發酵菌種的添加，使得乳酸發酵更加高效、可控。因此，研究應用及工業生產上都更偏愛利用發酵劑進行發酵。

而發酵劑的選擇可分為內源性和外源性，內源性發酵劑的使用意味著在同一種基質里分離和利用；外源性發酵劑意味著從一種基質中分離但用于其他基質中發酵[1]。目前廣泛應用于果蔬的商業發酵劑大多為外源發酵劑，而這往往存在以下幾個局限[1]：(1)選擇時除了快速酸化外沒有考慮其他特性；(2)對發酵基質的感官和功能性質適應性差；(3)不能有效利用生態系統的多樣性。

對優良發酵菌種的需求使人們將目光轉移至內源性菌種。內源性菌種的分離與運用在奶酪、發酵烘焙食品等產品上的運用已十分成熟，在腌菜制品、酒等產品上亦有運用，但在果蔬汁上的研究較少。DI等[2]研究對比了內源性菌種和外源性菌種在西紅柿汁中的發酵表現，內源性菌種的生長和酸化周期都更短，風味更佳，儲藏期更長，能維持更好的抗氧化性等功能特性。從黑樹莓[3]、奇異果[4]、櫻桃[5]等果蔬中分離出的內源性乳酸菌群均能在原本果蔬汁中代謝良好，有益于維持甚至提高果蔬汁的各項品質。然而，并不是所有組成蔬菜和水果的內源性菌種都可以達到期待的發酵效果[1]。

對內源性菌種的選擇、培養和利用類似于“老面法”，傳統“老面法”制作的食品及其他自然發酵制品中起主要發酵作用的往往是內源性和外源性菌種的混合菌群。內源性菌種和外源性菌種單獨或混合發酵時對產品的影響及其規律仍需深入探究。

梨含有豐富的糖、有機酸、維生素、氨基酸等營養物質，具有生津止渴，降低血壓，幫助消化等功效[6]，將梨汁的營養特性與乳酸菌的益生功能相結合可謂相得益彰。乳酸菌在梨汁中消耗葡萄糖、果糖、氨基酸等增殖代謝，產生乳酸、酯類、醇類等物質從而影響梨汁風味，發酵作用還會影響梨汁中具有抗氧化性的酚類物質。

本文以蜜梨為試材，通過選擇性培養從梨中分離出優勢乳酸菌，利用16S rDNA全序列測序鑒定為植物乳桿菌，以梨汁為對象，比對內源性植物乳桿菌和外源性市售植物乳桿菌LP-115單一或混合發酵對梨汁品質的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選擇成熟度合適、無明顯缺陷的市售蜜梨；直投式植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)菌粉LP-115 400B，杜邦·丹尼斯克公司提供；沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素、綠原酸、咖啡酸、表兒茶素(純度>98%)，Sigma公司。

1.2 儀器與設備

安捷倫7890B-7000C三重四級桿氣質聯用儀；手動進樣柄 65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙基苯(polydimethylsiloxane /divinylbenzene，PDMS/DVB)萃取頭，美國Supelco公司；全自動氨基酸分析儀L-8900，日本日立；1260 Infinity高效液相色譜儀，安捷倫公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療機械廠；SPX-150D-Z生化(恒溫)培養箱，上海博訊實驗有限公司醫療設備廠；752N紫外可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；HR1895榨汁機，飛利浦(中國)投資有限公司；CR-400色差儀，日本美能達公司等。

1.3 方法

1.3.1 內源性乳酸菌分離鑒定

在無菌環境下取50 g梨果肉與50 mL MRS肉湯混合,于37 ℃下培養72 h，并連續稀釋培養以篩選出乳酸菌，菌種鑒定交由上海美吉生物醫藥科技有限公司進行，測序結果分析在美國NCBI數據庫和德國DMSZ數據庫查詢，鑒定結果為植物乳桿菌。

1.3.2 樣品處理

梨洗凈，榨汁，過100目紗布；每150 mL分裝于250 mL潔凈錐形瓶中，硅膠塞密封，將果汁迅速加熱至80 ℃，水浴保溫10 min后迅速冷卻至40 ℃，準備接種。分別接種1.3.1所述內源性乳酸菌、植物乳桿菌LP-115 400B以及以上兩者按1∶1比例混合的菌種，控制接種量，使得分別接種以上3種不同菌種的梨汁的初始活菌數均為7.0 lg(CFU/mL)左右，于37 ℃恒溫箱靜置發酵24 h，測定各項指標。取殺菌冷卻后的未發酵梨汁為對照梨汁。

1.3.3 指標測定

pH，GB 10468—1989采用電位差法；總酸，GB/T 12456—2008采用酸堿滴定法；總糖，參考文獻[7]采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定；活菌數，參考GB 478935—2010采用稀釋平板計數法進行測定；色差值用L*、a*、b*、ΔE表示，平行測定3次，ΔE計算見公式(1)。

(1)

式中:L0、a0、b0為梨汁初始色差值，Ln、an、bn為測試樣的色差值。

1.3.4 揮發性風味物質測定[8-9]

HS-SPME方法：將初次使用的固相微萃取的萃取頭(PDMS/DVB 65 μm)在氣相色譜的進樣口老化，老化溫度為270 ℃，載氣體積流量為1.2 mL/min，老化時間為1 h。準確移取10 mL樣品于20 mL螺口進樣瓶中，加入3.0 g NaCl，促進香氣成分的揮發，用聚四氟乙烯隔墊密封，于磁力攪拌器中平衡，平衡溫度為45 ℃，平衡時間為20 min。平衡后將SPME萃取頭通過隔墊插入進樣瓶，插入深度為1 cm，推出纖維頭，使纖維頭置于樣品瓶頂空進行吸附，吸附時間為40 min，隨后取出萃取頭，并立即將萃取頭插入GC儀的進樣口，插入深度為2 cm，推出纖維頭，解析5 min，同時啟動儀器收集數據。

GC條件：DB-5MS毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；進樣口溫度 250 ℃，載氣為He，流速為 1.93 mL/min。不分流進樣。升溫程序：起始溫度為 40 ℃，保持3 min后以 4 ℃/min的速度升溫至 120 ℃，再以 6 ℃/min的速度升溫至240 ℃，保持9 min。

MS條件：電子轟擊電離(EI)，電子能量為70 eV，離子源溫度為230 ℃，接口溫度為230 ℃，質量掃描范圍為m/z35～500。

定性定量方法[8-9]：由GC-MS中NIST14質譜數據庫按匹配度和保留時間對各個物質進行檢索。選擇匹配度大于85的物質作為有效的香氣成分。按峰面積歸一化進行相對定量，以未發酵梨汁的揮發性風味物質的總峰面積為100，其他物質以其為基準算出相應比例計算揮發性風味物質的相對百分含量。

1.3.5 游離氨基酸測定方法

參考GB/T 5009.124—2006使用氨基酸自動分析儀進行測定，用10 g/L的三氯乙酸溶液將梨汁濃度稀釋到體積分數10%，8 000 r/min離心15 min，取上清液過0.45 μm濾膜上機測定。氨基酸自動分析色譜條件：4.0 m×125 mm C18柱，柱溫40 ℃，流速1.0 mL/min，波長Ex 340 nm、Em 450 nm，流動相A：20 mmol/L醋酸鈉溶液，流動相B：V(20 mmol/L醋酸鈉)∶V(甲醇)∶V(乙腈)=1∶2∶2。

1.3.6 HPLC測定酚類物質

色譜柱：Waters Symmetry C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：A為2%甲酸，B 為乙腈；柱溫：40 ℃；梯度洗脫程序：溶劑A在0～30 min為95%，在30～45 min由75%降至60%，在45～50 min維持60%，在50～51 min由60%上升至95%，維持10 min后返回初始狀態。流速：0.8 mL/min，檢測波長：280，320，360 nm，進樣量10 μL。以沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素、綠原酸、咖啡酸、表兒茶素為標準品，繪制標準曲線，計算樣品中各種多酚類化合物含量。

2 結果與討論

2.1 不同來源植物乳桿菌菌種在梨汁中增殖代謝情況

梨汁在發酵過程中pH和活菌數的變化反映了不同來源植物乳桿菌對發酵基質(梨汁)的適應情況(圖1)。與外源性植物乳桿菌相比，內源性植物乳桿菌在梨汁中增長、產酸速率更快，發酵24 h時pH值可降至3.30，活菌數從初始的7.0 lg CFU/mL達到10 lg CFU/mL，能更好地適應梨汁發酵。在對西紅柿[2]、胡蘿卜[10]、四季豆[10]等的乳酸菌發酵研究中，使用經過選擇的內源乳酸菌發酵時也較外源乳酸菌發酵時pH下降更快，推測與乳酸菌中代謝酶系及其適應性的差異有關。對當兩者按1∶1復合時，從pH和活菌數的變化來看，內源性和外源性植物乳桿菌復合發酵時，比兩者單一發酵時的增長、產酸速率都更快，最終達到的活菌數更高、pH更低，這體現出兩者在梨汁中混合發酵時存在一定協同作用。

圖1 不同來源菌種發酵梨汁pH及活菌數變化
Fig.1 The changes of pH and viable bacteria of pear
juices fermented by differentL.plantarum

梨汁中主要糖類為葡萄糖和果糖，植物乳桿菌在梨汁中增殖代謝，利用糖、氨基酸等營養物質發酵產生乳酸、蘋果酸等，使得果蔬汁中總酸含量增加、總糖含量下降，從而使得糖酸比發生變化，與前文梨汁中pH和活菌數變化情況相呼應，混合菌種在梨汁中消耗糖分產酸最高，表現出酸甜的味感(表1)。內源性和外源性植物乳桿菌單獨發酵時，外源性植物乳桿菌產酸更多，都表現為甜酸的味感。梨汁經乳酸發酵后pH降低，有利于抑制多酚氧化酶的活性從而降低梨汁褐變，因此發酵梨汁較未發酵梨汁的L*值(亮度)稍高，a*值較小，總色差值ΔE較小，說明發酵梨汁色差變化較小，但不同菌種發酵的梨汁其色差無顯著差異。

表1 不同來源菌種發酵梨汁指標差異Table 1 The attributes of pear juices fermented by different L. plantarum

2.2 不同來源菌種對揮發性風味物質的影響

從測得的揮發性風味物質的總峰面積及風味物質種類總數量看，不管是經過何種來源的植物乳桿菌發酵的梨汁的揮發性風味物質的總峰面積和種類數量均高于未發酵梨汁的總峰面積，說明發酵后梨汁中的風味物質含量和種類均顯著增加。而其中內源性和外源性植物乳桿菌混合發酵的梨汁的總峰面積和種類數最大，對梨汁風味的改變最顯著，內源性植物乳桿菌和外源性植物乳桿菌依次次之。三者在揮發性風味物質總峰面積和種類上的異同都從側面反應了內源性菌種和外源性菌種的協同作用。

經不同來源植物乳桿菌發酵后，梨汁中醛類物質含量均顯著減少，醛類是一種不穩定的化合物，且高濃度的醛類物質會產生異味[11]，醛類物質在微生物代謝活動下極易分解為醇或被氧化為酸[2]，觀察表2中各樣品中醇類物質和酸類物質的變化，發現內源性植物乳桿菌傾向于將醛類物質氧化為酸，而外源性植物乳桿菌則傾向于將醛類物質還原成為醇類，這與DI等[2]在西紅柿汁中的研究結論亦相吻合，這與不同的菌種在羰基化合物之間的平衡代謝機制有關[2]。而酸類、醇類物質的增加進而會使相應的酯類物質增加[12]，而乳酸菌發酵作用更會促使這一過程，例如乙酸乙酯可在乳酸菌檸檬酸發酵作用的促使下生成[13]。

表2 不同菌種發酵梨汁揮發性成分的種類及相對含量 單位：%

續表2

物質英文梨汁外源內源混合2-己基順芷酸烯丙酯2-Hexyl tiglate-0.32-1.17丙酸乙酯Propanoic acid, ethyl ester--1.220.842-丁烯酸乙酯2-Butenoic acid, ethyl ester--1.272.522-甲基-丁酸乙基酯Butanoic acid, 2-methyl-, ethyl ester--2.982.73反-2,3-二甲基丙烯酸乙酯Ethyl tiglate--1.202.31氯甲酸辛酯Octyl chloroformate--13.3315.31酯類物質總含量43.4769.9567.2768.27酯類物質種類3810135-(2-氨基丙基)-2-甲基苯酚5-(2-Aminopropyl)-2-methylphenol---0.602,4-二叔丁基苯酚2,4-Di-tert-butylphenol--2.552.39其他--20.3819.88總峰面積100.00126.27192.38230.38

注：本表以未發酵梨汁的揮發性風味物質的總峰面積為100，其他物質以其為基準算出相應比例；“-”表示這種物質和百分比含量為0。

以上都是發酵梨汁中醛類物質減少，而酸類、醇類和酯類物質增多的原因之一。在表2中，檢測得到的揮發性酯類物質中，2-丁烯酸乙酯、2-甲基-丁酸乙基酯等是梨果皮中散發香甜的果香的有效香氣成分[14]，在鮮榨全梨汁中或因含量低未檢出，但在內源性植物乳桿菌發酵梨汁和混合菌種發酵梨汁中檢出，推測內源性植物乳桿菌不僅能夠促進香氣物質的合成，還能推進釋放梨皮中的香氣物質從而使得梨汁發酵后香味更加濃郁。當內源性和外源性植物乳桿菌混合發酵時，各自促使增加的酸和醇使得酯類物質的種類數量進一步增加。揮發性酯類物質是梨中散發成熟梨果香的最重要的物質，賦予了梨“水果的香味”[15]。因此酯類物質濃度和種類的增加有利于梨汁香氣的突出。

除了酯類物質外，芳樟醇、1-己醇等醇類物質也是產生濃郁水果香味的重要物質[16]。外源性植物乳桿菌發酵后的梨汁中醇類物質種類增多，但1-己醇、2-甲基-1-丁醇和芳樟醇等在梨汁中原有的醇類物質含量卻有減少，內源性發酵的梨汁中則無這些醇類檢出，混合菌種發酵的梨汁中的1-己醇含量卻顯著增加。1-己醇是十分重要的脂肪酸代謝途徑的中間體，是在揮發性物質合成過程中比亞油酸和亞麻酸更有效的中間體[17]。1-己醇的顯著增加反映了混合菌種發酵梨汁中積極活躍的風味物質代謝。

單一與混合菌種發酵產物比較，個別組分在單菌發酵未能檢出(如1-溴-1,1,2,2-四氟-3-辛醇、環癸醇、5-(2-氨基丙基)-2-甲基苯酚)，而混合菌發酵中產生，或者在混合菌發酵中未能檢出(如己醛、1-壬、醇4-萜烯醇等)，而單菌種發酵中檢測到，這可能是由于不同來源的兩種菌其所含酶系的差異性及其代謝特性存在差別。相比單菌種發酵，混合菌發酵體系中，一種菌的代謝產物可能是另一種菌的代謝底物，同時也存在發酵產物間或發酵底物與產物之間等復雜的反應。相似機理有如保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的互惠共生作用，保加利亞乳桿菌代謝產物氨基酸為后者提供氮源[18]，而嗜熱乳桿菌為保加利亞乳桿菌提供甲酸、葉酸和CO2等[19]。

2.3 不同來源菌種對梨汁中酚類物質的影響

不同梨汁在加工和儲藏過程中酚類物質都有不同程度損失(圖2)，未發酵梨汁在儲藏期間酚類物質一直顯著迅速降低，在第30天酚類含量從初始的153.64 mg/L降低至25.16 mg/L，降低了84%。梨汁中不同的酚類物質降解損失程度有所差異，在沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素、綠原酸、咖啡酸、表兒茶素中，鮮榨梨汁中含量最高的是綠原酸(122.18 mg/L)、沒食子酸(14.17 mg/L)和表兒茶素(11.98 mg/L)，而各梨汁在儲藏過程中降解損失最快的是綠原酸，其他酚類物質則在儲藏第14天后開始快速下降。可見在梨汁中，綠原酸是含量最高且最不穩定的酚類物質。

圖2 不同來源菌種發酵梨汁酚類物質在儲藏期間變化
Fig.2 The changes of polyphenols of pear juices fermented
by differentL.plantarum

與未發酵梨汁相比，發酵梨汁酚類物質在儲藏期含量和穩定性都表現更優。發酵期間因乳酸菌的應激作用而對酚類物質進行的生物代謝[20]會導致發酵結束后梨汁中酚類物質減少[4]。但在儲藏期間，乳酸菌在梨汁中產生的各種有機酸、醇、酮等可抑制PPO活性物質，有利于防止酚類物質的氧化；再者，乳酸菌代謝過程中能產生酚酸酯酶等酶類，這些酶可釋放梨汁中的酚類物質[21]，而使得梨汁中酚類含量得到補償。內源性菌種發酵的梨汁在儲藏期酚類物質損失最少，其次是混合菌種發酵梨汁和外源菌種發酵梨汁。這從側面反映了與外源性植物乳桿菌相比，內源性植物乳桿菌對酚類物質的代謝分解程度更低，保存性更優。

2.4 不同來源菌種對梨汁中游離氨基酸的影響

植物乳桿菌具有多種氨基酸營養缺陷性，因此必須依賴外部氨基酸來增長代謝[22]，而微生物中酶的作用又會使蛋白質分解產生氨基酸。經乳酸菌發酵后，梨汁中游離氨基酸含量有不同程度的降低(圖3)，外源植物乳桿菌發酵后游離氨基酸總量從879.48 mg/kg降至510.21 mg/kg，其中組氨酸、半胱氨酸、異亮氨酸和絲氨酸含量降為0。內源性和混合菌種發酵梨汁中游離氨基酸總含量相對較高，分別為715.96 mg/kg和708.85 mg/kg，其中酪氨酸含量從7.70 mg/kg降為0，但梨汁中原本缺陷型的精氨酸、亮氨酸和甘氨酸經植物乳桿菌發酵后均有不同程度增加，有利于提高梨汁中游離氨基酸的多樣性。

圖3 不同來源菌種發酵梨汁游離氨基酸含量
Fig.3 The content of FAA of pear juices fermented by differentL.plantarum

3 結論

內源性植物乳桿菌和外源性植物乳桿菌均能在梨汁中進行良好代謝，與外源性植物乳桿菌相比，內源性植物乳桿菌在梨汁中增長、產酸速率更快，并且最終達到的活菌數更高、pH更低，能更好地適應梨汁進行發酵，除此之外內源性植物乳桿菌發酵梨汁中酚類物質保存性更優，且內源性植物乳桿菌代謝有助于提高梨汁中游離氨基酸的多樣性。發酵后梨汁中的風味物質含量和種類均顯著增加，對梨汁風味的改變顯著，內源性植物乳桿菌傾向于將醛類物質氧化為酸，而外源性植物乳桿菌則傾向于將醛類物質還原成為醇類，內源性植物乳桿菌不僅能夠促進香氣物質的合成，還能推進釋放梨皮中的香氣物質從而使得梨汁發酵后香味更加濃郁。將內源性植物乳桿菌和外源性植物乳桿菌混合發酵，兩者存在協同作用，在增殖代謝產酸、豐富揮發性風味物質，游離氨基酸、酚類物質保存方面均優于菌種單一發酵。