豌豆低聚肽硒螯合物制備及結構特征研究

秦修遠，劉文穎，陳立城，劉戚，魯軍，谷瑞增，蔡木易*，張春樂*

1(中國食品發酵工業研究院有限公司，北京市蛋白功能肽工程技術研究中心，北京，100015)2(廣東中食營科生物科技有限公司，廣東 東莞，523122)

大量科學研究表明，經蛋白酶水解蛋白質得到的生物活性多肽，具有很好的溶解性，更容易被消化吸收，并且具有許多獨特的生理功能[1]。豌豆低聚肽是對豌豆蛋白進行酶解得到的多肽，研究表明，豌豆低聚肽具有抗菌、抗氧化等生物活性[2]。硒是生物體內必不可缺的營養元素之一，具有抗氧化、抗腫瘤、提高機體免疫力等顯著生理功能，因此維持機體中合適的硒水平能夠預防多種疾病，如癌癥、克山病、大骨節病等[3-4]。世界上約有40個國家或地區缺硒，據統計我國約有2/3地區屬缺硒地區[5]。由此造成人體缺硒或低硒，對健康不利。

目前，人們可以通過藥物、硒營養強化劑、膳食等途徑補充硒，但是隨著分析化學、分子生物學、毒理學研究的不斷進步，人們發現硒的生理功能不僅與其含量有關，也與其形態相關[6]。與無機硒相比，有機硒具有更高的吸收率、生物活性強、毒性低等特點[7-8]。已有研究通過螯合的方式，將多肽與硒結合，但由于原料限制，產品的腥味去除和螯合率仍有待提高[9]。本研究將食源性豌豆低聚肽與亞硒酸鈉螯合，以期為有機硒補充劑的生產提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實驗材料

豌豆低聚肽，廣東中食營科生物科技有限公司；五水亞硒酸鈉(分析純)，天津市大茂化學試劑廠；3′3-二氨基聯苯胺(DAB 4HCl)。(試劑級)、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)(生物技術級)，Biotopped Amresco；氫溴酸(分析純)，天津市福晨化學試劑廠；鹽酸羥胺、高氯酸、硝酸、鹽酸、氫氧化鈉、95%乙醇(分析純)，均購自北京化工廠；超純水，實驗室自制。

1.1.2 實驗儀器

pH計(EL20)，Mettler Toledo；超聲波清洗器(KQ-250E)，昆山市超聲儀器有限公司；恒溫水浴鍋(1204007)，蘇州珀西瓦爾實驗設備有限公司；Phenom Prox臺式掃描電子顯微鏡、Dynex Spectra Mr酶標儀、Frontier FT-IR型傅里葉變換紅外光譜儀，Perkin Elmer； DHG-9075A電熱恒溫鼓風干燥箱，北京陸?？萍加邢薰?。

1.2 實驗方法

1.2.1 硒標準曲線的繪制

硒標準儲備溶液：準確稱取2.190 g Na2SeO3·5H2O，以少量超純水溶解后，加48%氫溴酸，然后以超純水定容至1 L，制備成657.474 6 mg/L的硒標準儲備溶液。

硒標準工作溶液：吸取1 mL硒標準儲備溶液，以超純水定容至100 mL，制備成6.57 μg/mL的硒標準工作溶液。

精確量取0、2、4、6、8、10 mL硒標準工作溶液，根據陳甫等[9]提出的分光光度法，以酸消解后測量3， 3’ -二氨基聯苯胺與還原硒反應后產生的黃色絡合物在420 nm處的吸光值。

按上述方法繪制，得到標準曲線如圖1所示。

圖1 硒標準曲線
Fig.1 Selenium standard curve

1.2.2 螯合物硒含量的測定

準確稱量一定量待測樣品，以10 mL超純水溶解后，采用上述方法處理樣品，測量處理后樣品的吸光值。對應標準曲線，確定螯合物硒含量。

1.2.3 硒的螯合率的計算

(1)

式中：m1為螯合物中硒元素的質量；m2為加入螯合體系硒元素的質量。

1.2.4 螯合物得率的計算

(2)

式中：m3為螯合產物質量；m4為加入螯合體系總物質的質量。

1.2.5 豌豆低聚肽硒螯合物制備工藝單因素試驗

1.2.5.1 豌豆低聚肽硒螯合物制備方法

豌豆低聚肽硒螯合物的制備工藝流程為：豌豆低聚肽→超純水溶解→加入亞硒酸鈉→超聲波混勻→調節pH值→恒溫螯合→醇沉→干燥得成品。

1.2.5.2 豌豆低聚肽硒螯合物單因素實驗設計

肽質量濃度設計為10 g/L，肽鹽質量比為2∶1，螯合pH值為8.5，分別在60、70、80、85、90 ℃條件下反應30 min。考察反應溫度對得率和螯合率的影響。

肽質量濃度為10 g/L，螯合pH值為8.5，螯合溫度為85 ℃，分別在肽鹽質量比為1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1的條件下反應30 min?？疾祀柠}質量比對得率和螯合率的影響。

肽鹽質量比為3∶1，螯合pH值為8.5，螯合溫度為85 ℃，分別在肽質量濃度為20，30，40，50 g/L的條件下反應30 min。考察肽質量濃度對得率和螯合率的影響。

肽質量濃度為40 g/L，肽鹽質量比為3∶1，螯合溫度為85 ℃，分別在螯合pH值為6.5、7、8、8.5、9的條件下反應30 min?？疾旆磻猵H值對得率和螯合率的影響。

肽質量濃度為40 g/L，肽鹽質量比為3∶1，螯合溫度為85 ℃，螯合pH值設計為8.5，分別反應20、30、40、50、60 min?？疾旆磻獣r間對得率和螯合率的影響。

1.2.6 豌豆低聚肽硒螯合物制備工藝優化正交試驗

在單因素實驗基礎上，選擇溫度、肽鹽質量比、pH值和肽質量濃度，進行正交實驗優化，篩選出豌豆低聚肽硒螯合物的最佳工藝制備條件。正交試驗因素水平如表1所示。

表1 正交實驗水平表Table 1 Orthogonal experiment level

1.2.7 豌豆低聚肽硒螯合物的結構特征

1.2.7.1 紫外全波長掃描

分別稱取豌豆低聚肽及豌豆低聚肽硒螯合物于超純水中，配制成0.05 g/mL溶液。對2組溶液進行全波長紫外掃描，掃描波長200～600 nm。

1.2.7.2 掃描電鏡

分別將豌豆低聚肽及豌豆低聚肽硒螯合物干粉樣品涂抹在樣盤雙面膠上，然后進行氮吹處理。處理好的樣品放入掃描電鏡抽真空，施加一定的電壓，調整束斑尺寸待聚焦清晰后分別在×1 000倍數下獲取圖像，觀察。

1.2.7.3 傅里葉紅外光譜掃描

稱取豌豆低聚肽10 mg和干燥的光譜純KBr 1 000 mg置于瑪瑙研缽中，研磨均勻后壓片得到透明的KBr樣品片，利用傅里葉紅外光譜儀進行定性分析。同樣方法對豌豆低聚肽硒螯合物進行紅外光譜測定。

儀器參數設置：光譜范圍為 4000～400 cm-1；分辨率 4 cm-1，掃描時扣除水和二氧化碳的干擾。

1.2.8 數據處理

采用SPSS v20處理實驗數據，結果采用單因素方差分析。

2 結果與討論

2.1 豌豆低聚肽的基礎理化成分

豌豆低聚肽中總蛋白含量為88.30%，酸溶蛋白含量為84.20%，水分含量為4.46%，灰分含量為5.04%，游離氨基酸含量(以干基計)為2.93%，水解氨基酸含量為66.82%，肽含量(以干基計)為81.27%。

2.2 豌豆低聚肽硒螯合物制備工藝單因素實驗結果

2.2.1 反應溫度對螯合結果影響

在化學反應中，溫度是影響反應進程的一個不可忽略的因素。從圖2可以看出，隨著溫度的升高，螯合率和得率都逐漸升高，說明溫度的升高有助于螯合過程的進行。當溫度超過85 ℃時，得率逐漸下降，而螯合率基本保持不變，說明過高的溫度會阻止反應進行。經方差分析，85與80 ℃組的得率為差異顯著(P<0.05)，與組間(除80 ℃)為差異極其顯著(P<0.01)，85 ℃螯合率與80 ℃組和90 ℃組差異不顯著，與組間(除80、90 ℃)差異極顯著(P<0.01)。因此，綜合2項指標，溫度選擇為85 ℃。

圖2 溫度對螯合反應的影響
Fig.2 Effects of temperature on the chelating reaction

2.2.2 肽鹽質量比對螯合結果影響的研究

在化學反應過程中，反應物的相對比例可能對一些空間鍵位的形成構成影響。從圖3可以看出，隨著肽鹽質量比(肽∶鹽)的逐漸增加，螯合率逐漸減少，而得率逐漸增加，兩項指標的變化趨勢相反，隨著肽鹽比的增加，肽濃度保持不變，則鹽的質量減少。

圖3 肽鹽質量比(肽∶鹽)對鰲合反應的影響
Fig.3 Effects of the mass ratio of oligopeptideto salt
on the chelating reaction

鹽質量的減少，是導致螯合率下降的主要原因。但當肽鹽質量比超過3∶1時，產物得率也呈下降趨勢，而螯合率的下降趨勢逐漸平緩。肽鹽質量比為3∶1時，螯合得率最高。經方差分析，在3∶1時的得率和螯合率與組間相比，差異極顯著(P<0.01)。綜合2項指標，肽鹽質量比選擇為3∶1。

2.2.3 肽濃度對螯合結果影響的研究

在化學反應過程中，除了反應速率，反應物的濃度也是影響反應進行程度的重要因素。從圖4可以看出，隨著肽濃度的增加，螯合率與得率都呈現了先增加再穩定后減小的變化趨勢?；瘜W反應是一個動態平衡的過程，若產物在反應體系中濃度很高，則不利于反應的正向進行。平穩的濃度即達到了化學平衡的最適濃度。經方差分析，肽質量濃度為30 g/L時的得率和螯合率與組間(除40 g/L外)2項指標相比為差異極顯著(P<0.01)，與40 g/L的2項指標為不顯著。綜合2項指標，且從節約肽的經濟角度出發，選擇肽質量濃度為30 g/L。

圖4 肽濃度對鰲合反應的影響
Fig.4 Effects of the concentration of oligopeptideon on
the chelating reaction

2.2.4 反應pH值對螯合結果影響的研究

從圖5可以看出，隨著溶液pH值的增加，螯合率和得率整體上都呈增加趨勢，但是pH值超過8以后，2項指標呈下降趨勢并逐漸趨于平緩。說明該鰲合反應在弱堿性的環境下有更好的反應結果。從表2經方差分析，在pH=8時，得率和螯合率與組間相比均為極顯著差異(P<0.01)。

圖5 pH值對鰲合反應的影響
Fig.5 Effects of the pH value on the chelating reaction

當豌豆低聚肽與亞硒酸鈉完全溶解時，溶液的pH值即為8左右。因此，綜合2項指標，選擇pH=8。

2.2.5 反應時間對螯合結果影響的研究

由圖6可以看出，隨著螯合時間的延長，螯合率和得率都逐漸增加。當螯合時間超過30 min時，螯合率與得率都下降，并在一定值的范圍內波動。經方差分析，30 min的得率和螯合率與20 min組的2項指標達到了差異極顯著(P<0.01)，與組間(除20 min組外)為差異顯著(P<0.05)。40、50、60 min組間2項指標差異不顯著。綜合2項指標，選擇螯合時間為30 min。

圖6 反應時間對螯合反應的影響
Fig.6 Effects of reaction time on the chelating reaction

2.3 豌豆低聚肽硒螯合物制備正交實驗結果

綜合以上單因素試驗的結果，以豌豆低聚肽硒的螯合率和得率為指標，采用L9(34)正交試驗優化豌豆低聚肽硒螯合物的制備工藝。結果如表2所示。

表2 豌豆低聚肽硒螯合物正交試驗結果Table 2 Orthogonal experiment results of the peaoligopeptideselenium chelate

以得率為指標，由表2可看出,各因素對豌豆低聚肽硒螯合物得率的影響大小依次為：肽鹽比>肽質量濃度>pH值>溫度。最佳因素組合為A1B3C1D3，即螯合溫度80 ℃，豌豆低聚肽濃度為5%，肽鹽質量比為2∶1，螯合pH值為8，反應時間為30 min。

以螯合率為指標，由表2可看出各因素對豌豆低聚肽硒螯合物螯合率的影響大小依次為肽鹽比>pH值>肽濃度>溫度。最佳因素組合為A1B3C3D3，即螯合溫度80 ℃，豌豆低聚肽濃度為5%，肽鹽質量比為2∶1，螯合pH值為9，反應時間為30 min。

綜合以上2項指標，確定豌豆低聚肽硒螯合物最佳制備工藝為螯合溫度80 ℃，豌豆低聚肽質量濃度為50 g/L，肽鹽質量比為2∶1，螯合pH值為9，反應時間為30 min。

2.4 豌豆低聚肽硒螯合物的結構特征

2.4.1 紫外全波長掃描

分別將配制成0.05 g/mL溶液的豌豆低聚肽和豌豆低聚肽硒螯合物進行全波長紫外掃描，掃描波長200～600 nm。結果如圖7所示。

圖7 豌豆低聚肽與豌豆低聚肽硒螯合物紫外
全波長掃描圖
Fig.7 UV scanning analysis of the pea oligopeptide
and pea oligopeptide selenium chelate

由圖7可以看出，豌豆低聚肽在309 nm處有最大吸收峰，當豌豆低聚肽與亞硒酸鈉螯合形成豌豆低聚肽硒螯合物時，最大吸收峰紅移到322 nm處，并且最大吸收峰的OD值也變大，證明螯合使物質的結構發生變化，硒元素與肽的配合形成對光吸收性能更強的結構，這是豌豆低聚肽與硒螯合后，價電子躍遷程度變化的結果。

2.4.2 掃描電鏡

由圖8可以看出，在螯合前(圖8-a)，豌豆低聚肽具有明顯的球體顆粒狀，在1 000放大倍數下，可以看出豌豆低聚肽顆粒表面都存在褶皺，完整顆粒的粒徑均小于50 μm。由圖8-b可以看出，經過螯合后，豌豆低聚肽硒螯合物粒型變化較大，失去球狀形態。最遠粒徑大于300 μm。豌豆低聚肽硒螯合物的表面褶皺大部分伸展開，并且存在孔洞。推測是經過螯合，豌豆低聚肽表面展開，結構發生變化，以提供與硒的結合位點。顆粒前后變化明顯，證明是2種物質。

圖8 豌豆低聚肽(a)和豌豆低聚肽硒螯合物(b)的
掃描電鏡圖
Fig.8 Scanning electron microscope of the pea oligopeptide
(a) and pea oligopeptide selenium chelate (b)

2.4.3 傅里葉紅外光譜結果分析

豌豆低聚肽與螯合物的吸收峰相比，峰的形狀出現了變化，如圖9所示。豌豆低聚肽在3 040、954附近有吸收峰，說明存在—COOH，而螯合物在3 040附近的吸收峰變窄，954附近吸收峰變得很弱，說明游離羧基不存在，可能是羧基以共價鍵形式與硒配合。螯合物在3 158和3 436附近有雙峰，在1 216附近有峰，說明存在—NH2，且—NH2為自由的。從理論上分析，肽硒螯合物的螯合機制為Se4+與—NH2配合，羧基以共價鍵方式也與Se形成配合。推測豌豆低聚肽硒螯合物中，由Se4+提供4 d空軌道，N、O能夠提供孤對電子，可分別占據空軌道形成配位鍵。這一推測也與其他相關研究相符[11-12]。

圖9 豌豆低聚肽和豌豆低聚肽硒螯合物紅外
光譜對比
Fig.9 Infrared radiation spectrum of the pea oligo-
peptide and pea oligopeptide selenium chelate

3 結論

豌豆低聚肽與亞硒酸鈉螯合制備豌豆低聚肽硒螯合物的最佳工藝制備條件為：螯合溫度80 ℃，豌豆低聚肽質量濃度50 g/L，肽鹽質量比為2∶1(肽∶鹽)，pH=9，時間30 min。在此條件下的產物得率為27.87%，螯合率為57.23%。

通過紫外全波長掃描的結果可以看出，由于豌豆低聚肽與硒元素螯合后，相應的原子價電子躍遷發生變化，因此豌豆低聚肽硒螯合物的最高吸收峰發生紅移，且吸收峰更強；掃描電鏡結果顯示豌豆低聚肽經過螯合，其微觀形態發生變化，表面褶皺舒展，以提供與硒配合的位點，最終配體顆粒體積變大；傅里葉紅外光譜結果顯示，螯合反應使豌豆低聚肽的結構發生變化，推斷是硒離子可與多肽中NH2+以及—COO—形成配位鍵，豌豆低聚肽硒螯合物是一種新型含硒的螯合物。本實驗開辟了補硒產品的新思想，為進一步產業化奠定了理論基礎。