窖泥中高產愈創木酚類功能菌的篩選與鑒定

周金虎，李良，方尚玲，董孝元，張超，陳茂彬*

1(發酵工程教育部重點實驗室(湖北工業大學),湖北 武漢,430068) 2(黃鶴樓酒業(咸寧)有限公司,湖北 咸寧,437000)3(工業發酵湖北省協同創新中心,湖北 武漢,430068) 4(工業微生物湖北省重點實驗室,湖北 武漢,430068)

白酒作為中國的國酒，有數千年的歷史，很多重要的場合都離不開白酒的身影，白酒已成為我國文化的一部分[1]。近年來，越來越多的科研工作者投入到白酒中健康因子的研究中來。茅臺、瀘州老窖等白酒企業對白酒與人體健康的關系進行了詳細調查，發現茅臺酒有多種保健功效[2]。李大和等[3]報道了白酒中的一些微量活性成分對人體健康的影響。張金修等[4]報道4-乙基愈創木酚是優良的自由基清除劑，具有良好的活性氧消除功能，可抗氧和預防心血管等多種疾病的發生，具有預防疾病、抗衰老、促進人體健康的作用。

目前，產愈創木酚類物質主要是一些芽孢桿菌和圓酵母[5]。王霜等[6]報道從濃醬兼香型酒醅中篩選出2株高產4-乙烯基愈創木酚的菌株，分別是地衣芽孢桿菌LS9和枯草芽孢桿菌S10。王少磊等[7]報道從濃香型大曲中篩選到1株高產4-乙基愈創木酚的菌株，經鑒定為解淀粉芽孢桿菌EG06。

本試驗旨在從窖泥中篩選出幾株高產愈創木酚類物質的功能菌，為細菌麩曲制作提供菌株，以期為白酒生產實踐提供參考，提高白酒中愈創木酚類物質的含量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品：黃鶴樓酒濃香型窖泥。

菌種分離培養基[8]：肉湯固體培養基：牛肉膏質量濃度為3 g/L、蛋白胨質量濃度為10 g/L、氯化鈉質量濃度為5 g/L，瓊脂粉質量濃度為20 g/L，pH自然，121 ℃下滅菌20 min。

耐受性篩選基礎培養基：肉湯液體培養基。

種子培養基：肉湯液體培養基。

發酵培養基(麩皮培養基)[7]：麩皮5 g，加水95 mL，混勻后分裝于250 mL三角瓶121 ℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設備

5977B—7890B氣相色譜質譜聯用儀(gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS),美國安捷倫公司；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺,蘇州凈化設備有限公司；LRH-250生化培養箱,上海一恒科學儀器有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋,上海申安醫療器械廠；DYY-7B電泳儀，北京六一儀器廠；Millipore純水儀等。

1.3 方法

1.3.1 菌種的初步分離純化[8]

無菌條件下，取5 g窖泥于95 mL 0.9%無菌生理鹽水中，稀釋度為10-2，搖床中振蕩30 min，然后用移液槍取1 mL稀釋度為10-2的稀釋液于9 mL 0.9%無菌生理鹽水中，稀釋度為10-3，依次類推，直至10-6，然后用移液槍吸取200 μL稀釋液于肉湯固體培養基平板上涂布均勻，取10-4、10-5、10-6三個稀釋度進行涂布，每個稀釋度涂2塊平板，于37 ℃恒溫箱倒置培養24 h，觀察菌落特征并進行編號。

無菌條件下，用接種環挑取稀釋涂布生長后的各菌，于肉湯固體培養基平板上劃線，于37 ℃恒溫箱倒置培養24～36 h。

鏡檢：取平板劃線長好的各編號單菌落進行鏡檢觀察，確定細菌和酵母菌，對細菌采用革蘭氏染色。

1.3.2 高產愈創木酚類物質功能菌的篩選[10-12]

試驗組：將初步分離得到的各菌種按5%的接種量(v/m)接入發酵培養基中，于37 ℃、160 r/min條件下培養6 d。空白組：麩皮5 g，加水95 mL，混勻后分裝于250 mL三角瓶，不接入菌種，于37 ℃、160 r/min條件下培養6 d。

樣品處理：取100 mL麩皮發酵液于500 mL蒸餾燒瓶中，加100 mL 50%vol乙醇混勻后真空旋轉濃縮，收集餾出液100 mL。

愈創木酚類物質的定量檢測：用GC-MS進行檢測，采用外標法定量。愈創木酚類標準溶液的配制：愈創木酚、4-甲基愈創木酚、4-乙基愈創木酚標品分別用無水乙醇配制10.0 mg/L的標準溶液(母液)，取適量體積質量濃度為10.0 mg/L的愈創木酚、4-甲基愈創木酚、4-乙基愈創木酚混合制備系列標準工作溶液，使愈創木酚、4-甲基愈創木酚、4-乙基愈創木酚的質量濃度均為100.0～5 000.0 μg/L(即5 000.0、3 000.0、2 500.0、1 000.0、500.0、250.0、100.0 μg/L)，將標準工作液儲存于-4 ℃備用。

樣品處理采用頂空固相微萃取法，氣相色譜儀條件為：色譜柱型號DB-WAX，進樣口溫度260 ℃，采用不分流模式進樣，初始柱溫50 ℃，保持0 min；以20 ℃/min速度升溫至150 ℃，保持0 min；以10 ℃/min速度升溫至220 ℃，保持5 min；總分析時間為17 min。載氣為氦氣，恒定流速為1.0 mL/min。

質譜條件：電離方式：EI；掃描類型SIM掃描；電離能量：70 eV；離子源溫度230 ℃；MS四級桿溫度150 ℃；閾值100；掃描/s為2.67；掃描質量數50～500 amu。

根據7個不同濃度愈創木酚類標準溶液對應的氣相色譜圖，找到相對應色譜峰面積，作出色譜峰面積-濃度標準曲線。已知被測樣品氣相色譜圖中愈創木酚類色譜峰面積，根據對應標準曲線線性方程計算出處理后的樣品中愈創木酚類的濃度。

1.3.3 菌種的分子生物學鑒定[13]

對高產愈創木酚類物質的菌株進行鑒定。

菌體制備和裂解：在酒精燈火焰旁取培養基上的菌株于研缽，液氮研磨；將研磨好的菌至1.5 mL離心管中，標記菌名稱，加入0.6 mL TE(pH 8.0)，用槍頭吸打均勻，使菌體充分懸浮；加入250 μL 10% SDS，輕輕倒轉混勻；加入3 μL蛋白酶K(20 ng/μL)，輕輕混勻，37 ℃水浴1 h；

DNA抽提：加入150 μL 5 mol/L NaCl，輕輕混勻；加入150 μL 2% CTAB，輕輕混勻，65 ℃水浴20 min；12 000 r/min常溫離心20 min；

DNA沉淀：小心吸取上清至新的1.5 mL離心管，加入等體積異丙醇，充分混勻，室溫放置30 min，12 000 r/min，4 ℃離心10 min；吸掉上清，在吸水紙上空干液體，加750 μL 70%乙醇，輕彈管壁，使沉淀懸浮并反復顛倒幾次，12 000 r/min，4 ℃離心2 min；每管加入30 μL純化水溶解沉淀(水中加Rnase，終濃度10 ng/μL)，用手輕彈管壁，4 ℃溶解過夜；DNA電泳檢測；PCR擴增。

16 s 引物序列：27F:AGAGTTTGATCMTGGCTCAG;1492R:TACGGYTACCTTGTTACGACT。

PCR反應體系(30 μL)：H2O 17.8 μL；Buffer 3 μL，d NTP 2 μL，Primer1 3 μL，Primer2 3 μL，DNA模板1 μL，酶0.2 μL。

PCR產物電泳鑒定，上機測序，輸出峰圖。

1.3.4 菌種耐受性分析[9]

耐酒精能力測定：制備初始酒精濃度分別為0、4、8、10、12、14%vol的液體培養基，將平板純化后的各單菌種按2%的接種量接到各培養基中，于37 ℃、160 r/min培養24 h，然后于600 nm分別測定吸光度，每個樣品測3次取平均值。

耐酸性能力測定：制備初始pH值分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5的液體培養基，將平板純化后的各單菌種按2%的接種量接到各培養基中，于37 ℃、160 r/min培養24 h，然后于600 nm分別測定吸光度，每個樣品測3次取平均值。

耐糖性能力測定：制備初始葡萄糖質量分數分別為5%、10%、15%、20%、30%的液體培養基，將平板純化后的各單菌種按2%的接種量接到各培養基中，于37 ℃、160 r/min培養24 h，然后于600 nm分別測定吸光度，每個樣品測3次取平均值。

2 結果與分析

2.1 菌種的初步分離純化

通過對窖泥稀釋涂布、平板劃線純化、鏡檢共初步分離得到3株酵母菌，14株細菌，細菌分別編號為B-1、B-2、B-3、B-4、B-5、B-6、B-7、B-8、B-9、B-10、B-11、B-12、B-13、B-14。14株菌鏡檢圖見圖1，菌落形態及顯微形態見表1。

圖1 14株菌鏡檢圖(10×100)
Fig.1 Microscopic examination of 14 strains (10×100)

表1菌落形態及顯微形態
Table1Colonymorphologyandmicroscopicmorphology

菌株菌落形態顯微形態B-1不透明、表面干燥、邊緣整齊規則、扁平桿狀,芽孢桿菌,革蘭氏陽性菌B-2半透明、表面光滑濕潤、邊緣整齊規則、臍狀桿狀,芽孢桿菌,革蘭氏陽性菌B-3淡黃色、不透明、表面光滑濕潤、圓形、邊緣整齊規則、扁平桿狀,芽孢桿菌,革蘭氏陽性菌B-4乳白色、不透明、邊緣不整齊、表面干燥、隆起桿狀,芽孢桿菌,革蘭氏陽性菌B-5乳白色、半透明、邊緣不整齊、表面干燥、低凸起桿狀,芽孢桿菌,革蘭氏陽性菌B-6透明、邊緣整齊規則、表面干燥、扁平桿狀,革蘭氏陰性菌B-7半透明、顆粒狀不規則、表面黏稠濕潤、扁平桿狀,芽孢桿菌,革蘭氏陰性菌B-8半透明、邊緣齒狀規則、表面黏稠濕潤、隆起桿狀,芽孢桿菌,革蘭氏陽性菌B-9透明、邊緣整齊規則、表面干燥、草帽狀桿狀,芽孢桿菌,革蘭氏陽性菌B-10半透明、邊緣波浪狀不規則、表面濕潤、扁平桿狀,革蘭氏陽性菌B-11透明、邊緣整齊不規則、表面濕潤、隆起桿狀,革蘭氏陽性菌B-12圓形、不透明、邊緣整齊、表面干燥、隆起桿狀,芽孢桿菌,革蘭氏陽性菌B-13圓形、透明、邊緣整齊、表面濕潤、扁平桿狀,革蘭氏陽性菌B-14微黃色、邊緣整齊不規則、表面濕潤黏稠、隆起桿狀,革蘭氏陽性菌

2.2 高產愈創木酚類物質功能菌的篩選

對初步分離得到的14株菌進行單菌發酵。通過GC-MS分別對不同濃度混標和樣品進行測定，得出3種愈創木酚類物質的標準曲線(見圖2)，3種愈創木酚類物質的SIM參數見表2，3種愈創木酚類物質標準曲線見表3，14株菌單菌發酵樣品中愈創木酚類物質含量見表4，部分菌株單菌發酵色譜圖見圖3、圖4。

圖2 三種愈創木酚類物質色譜峰面積-濃度標準曲線圖
Fig.2 Chromatographic peak area-concentration
standard curve of three guaiacols

表23種愈創木酚類物質的SIM參數
Table2SIMparametersofthreeguaiacols

序號保留時間名稱定性、定量離子18.420愈創木酚81.0、109.0、124.029.2404-甲基愈創木酚95.0、123.0、138.039.8694-乙基愈創木酚122.0、137.0、152.0

表3 3種愈創木酚類物質標準曲線表Table 3 Standard curve of three guaiacols

表414株菌發酵液中愈創木酚類物質含量單位：μg/L

Table 4 Contents of guaiacols in the fermentation brothof 4 strains

注：愈創木酚類物質含量總量為平均值±標準偏差(n=3)。

圖3 B-1單菌發酵氣相色譜圖
Fig.3 Gas chromatogram of B-1 bran single bacteria
fermentation

圖4 B-3單菌發酵氣相色譜圖
Fig.4 Gas chromatogram of B-3 bran single fermentation

由表2可以看出，愈創木酚、4-甲基愈創木酚、4-乙基愈創木酚的保留時間分別為8.420、9.240、9.869，由表3可以看出3種愈創木酚類物質標準樣品的線性相關系數均在0.99以上，可以用于準確定量，根據線性方程可分別計算出各樣品中對應愈創木酚類物質的含量。表4可以看出菌株B-8、B-13未檢出愈創木酚類物質，菌株B-1發酵液中愈創木酚類物質含量總量為3 632.33μg/L，菌株B-3發酵液中愈創木酚類物質含量總量為14 527.31μg/L，高于另外12株菌發酵液中愈創木酚類物質含量總量，同時空白組未檢出愈創木酚類物質，所以選擇菌株B-1、B-3進行分子生物學鑒定。王少磊等[7]從中高溫大曲中篩選到1株產4-乙基愈創木酚的菌株，經鑒定為Bacillusamyloliquefaciens，產量為32.89 μg/g。

2.3 菌種分子生物學鑒定

提取菌株B-1、B-3基因組DNA，然后以基因組DNA為模板經PCR擴增出16S rDNA序列，其瓊脂糖凝膠電泳檢測圖見圖5。

圖5 菌種基因組DNA PCR產物電泳圖
Fig.5 Electrophoresis map of strain genomic DNA PCR
products

將菌株B-1的16S rDNA(長度1 458 bp)序列輸入美國國家生物技術信息中心(NCBI)數據庫中Nucleotide BLAST與GenBank數據庫中同源性最高的已知分類菌株序列進行比較，菌株B-1與Bacillusamyloliquefaciens(KP686226.1)同源性最高為99%，因此可以鑒定菌株B-1為Bacillusamyloliquefaciens[14]。

將菌株B-3的16S rDNA(長度1 416 bp)序列輸入美國國家生物技術信息中心(NCBI)數據庫中Nucleotide BLAST與GenBank數據庫中同源性最高的已知分類菌株序列進行比較，菌株B-3與Delftiasp.X-a12(JX997845.1)同源性最高為99%，因此可以鑒定菌株B-3為Delftiasp.X-a12[15]。

2.4 菌種耐受性分析

2.4.1 耐酒精能力測定

菌株B-1、B-3耐酒精能力測定見圖6、圖7。

圖6 B-1耐酒精能力測定
Fig.6 B-1 determination of alcohol resistance

圖7 B-3耐酒精能力測定
Fig.7 B-3 determination of alcohol resistance

通過對篩選到的高產愈創木酚類物質菌株B-1、B-3進行耐酒精能力測定，由圖6、圖7可以看出，隨著酒精濃度的增加，OD值均呈不斷下降趨勢，當酒精度達8%vol時，基本上不能生長，OD值接近0，此時菌株生長受到明顯抑制，當酒精度為4%vol時，菌株B-1 OD值為0.462，菌株B-3 OD值為1.659，說明菌株B-1、B-3耐4%vol酒精度能力較強,但B-3比B-1更耐4%vol酒精度。

2.4.2 耐酸能力測定

菌株B-1、B-3耐酸能力測定圖見圖8、圖9。

圖8 B-1耐酸能力側定
Fig.8 B-1 acid resistance ability side

圖9 B-3耐酸能力測定
Fig.9 B-3 acid resistance test

通過對篩選到的高產愈創木酚類物質菌株B-1、B-3進行耐酸能力測定，由圖8、圖9可以看出，隨著pH值的不斷增加，OD值均呈不斷上升趨勢，當pH值小于4時，菌株生長均收到明顯的抑制，OD值接近于0。當pH為4.5時，基本上均能正常生長，B-1 OD值為1.345，B-3 OD值為1.815，說明B-3耐酸能力相對較強。

2.4.3 耐糖能力測定

菌株B-1、B-3耐糖能力測定見圖10、圖11。

圖10 B-1耐糖能力測定
Fig.10 B-1 sugar tolerance test

圖11 B-3耐糖能力測定
Fig.11 B-3 sugar tolerance test

通過對篩選到的高產愈創木酚類物質菌株B-1、B-3進行耐糖能力測定，由圖10、圖11可以看出，隨著糖度的不斷增加，菌株B-3 OD值呈先上升后下降趨勢，B-1 OD值呈不斷下降趨勢。原因可能為隨著糖度的增加，B-3利用糖的能力較強，在糖度為15%時為菌株提供了充足的碳源，菌株可以良好的生長，當糖度達20%時由于受高滲透壓的影響菌株生長受到抑制，超過了菌株所需要碳源的量，所以又呈下降趨勢。而B-1在糖度15%以下時利用碳源的能力相對較弱，受高糖滲透壓的影響較大，當糖度為20%時，OD值基本接近于0。

3 結論

白酒作為我國的國酒，歷史悠久，源遠流長，不僅因為能起到助興的作用，更重要的是具有重要的保健功效。愈創木酚類物質作為白酒中重要的健康因子之一，近年來越來越受到科研工作者的關注。本試驗以窖泥為樣品，通過稀釋涂布、平板劃線純化、鏡檢、單菌發酵篩選出高產愈創木酚類物質的功能菌株，然后進行菌種鑒定，最后進行菌種的耐受性分析，最終篩選出2株高產愈創木酚類物質的功能菌B-1、B-3，分別為Bacillusamyloliquefaciens、Delftiasp.X-a12，總產量分別為3632.33和14527.31μg/L，耐受性分析結果為菌株B-1、B-3均耐4%vol酒精度、pH 4.5、15%糖度，為細菌麩曲制作提供菌株和條件，以期為白酒生產實踐提供參考，提高白酒中愈創木酚類物質的含量，提高黃鶴樓濃香型白酒的營養健康保健的功效。蔡瑞[11]報道愈創木酚含量過高會產生一種類似于苯酚類化合物的“藥味”和“消毒水味”，給酒的香氣帶來不愉快的氣味，所以白酒中愈創木酚類物質含

量應恰到好處，不應要求越高越好，含量過高反而會破壞酒的風味上的平衡協調，產生欠缺，需要考慮的是如何使其在白酒中保持一個適當的含量，這也是以后研究的重點。