魯氏不動桿菌Acinetobacter lwoffii UL產類胡蘿卜素的純化與鑒定及其抗氧化活性檢測

盛冉，孫志高，張震，方明，于奉生，張群琳，李甜

(西南大學 柑桔研究所，重慶，400712)

類胡蘿卜素是普遍存在于自然界的萜類化合物，在動物和人體內可發揮抗氧化，調節免疫系統、生長因子和細胞內信號通路，調節細胞分化、細胞周期和細胞凋亡，還具有抵抗紫外輻射功能，也是維生素A的前體物質[1]。由于人體自身不能合成類胡蘿卜素，故必須從食物中獲取。目前，已有600多種類胡蘿卜素被發現，主要分為兩類：一是葉黃素類，具有含氧的功能性基團，如蝦青素，葉黃素和玉米黃素等；二是胡蘿卜素類，由無官能團的烴鏈構成，如β-胡蘿卜素和番茄紅素等。目前，國內外廣泛采用藻類發酵生產類胡蘿卜素，且其他微生物發酵類胡蘿卜素極具發展潛力，如三孢布拉氏霉發酵番茄紅素和β-胡蘿卜素[2]、粘紅酵母發酵蝦青素[3]等。但因微生物源類胡蘿卜素存在純度低、雜質多等缺陷，所以其純化必不可少[4]。

魯氏不動桿菌(Acinetobacterlwoffii)又稱洛菲不動桿菌，是革蘭氏陰性、好氧、桿菌，廣泛分布于正常人體的皮膚和口咽，占人體正常菌群的20%～25%。不動桿菌不需要復雜的營養成分，能夠以多種物質作為單一的能量來源，因此，不動桿菌廣泛分布于土壤、水體以及干燥的環境中[2-5]。魯氏不動桿菌發酵產類胡蘿卜素鮮有報道，因此探明其所產類胡蘿卜素種類極有必要性。

目前，微生物源類胡蘿卜素的純化主要通過薄層層析(TLC)、硅膠柱層析、制備柱色譜等手段分離純化類胡蘿卜素各組分。依據類胡蘿卜素的結構特性采用紫外-可見光譜掃描、高效液相色譜(HPLC)、高效液相色譜-質譜聯用、傅里葉紅外光譜掃描、核磁共振氫譜以及核磁共振碳譜等方法進行鑒定。

現代許多研究已證實癌癥、衰老和大多數疾病的產生都與體內過量自由基的產生相關，所以抗氧化的研究具有很大潛力[5-6]。抗氧化研究有體內和體外兩大類方法，通常廣泛采用的是體外抗氧化測定方法[7-8]。本試驗先用TLC和柱層析對類胡蘿卜素進行純化，再將純化后的色素利用HPLC、1H-NMR、FRIT和Q-TOF-HPLC-MS-MS進行鑒定。類胡蘿卜素生理活性的發揮依賴其抗氧化活性，故本試驗采用ABTS、DPPH、FRAP三種方法對色素粗提液和純化后的組分1、組分2進行了抗氧化活性的評價和對比。以期為魯氏不動桿菌(AcinetobacterlwoffiiUL)類胡蘿卜素在食品、醫藥及化工產業的應用提供一定的指導。

1 材料與方法

1.1 材料

魯氏不動桿菌UL(AcinetobacterlwoffiiUL)，保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號CCTCC M 2017776。

R2A液體培養基：酵母粉0.5 g、胰蛋白胨0.5 g、魚蛋白胨0.5 g、葡萄糖0.5 g、可溶性淀粉0.5 g、K2HPO40.3 g、MgSO4·7H2O 0.05 g、丙酮酸鈉0.3 g，加蒸餾水至1 L，調節pH值至6.5。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試驗試劑

柱層析硅膠200～300目，青島海洋化工廠；薄層層析板F254，德國默克；DPPH、TPTZ、ABTS、乙腈，色譜純，Sigma公司；甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚(沸程60～90℃)、正庚烷、二氯甲烷、醋酸，純度均為分析純，購自重慶川東化工(集團)有限公司；溴化鉀、過硫酸鉀、醋酸鈉，成都市科龍化工試劑廠。酵母粉、胰蛋白胨、魚蛋白胨，北京奧博星生物技術有限責任公司；可溶性淀粉、K2HPO4、MgSO4·7H2O，成都市科龍化工試劑廠；丙酮酸鈉，Bio Basic Inc。

1.2.2 試驗儀器

臺式低速大容量離心機(L-550)，長沙湘儀離心機儀器有限公司；恒溫培養箱(SPX-150-Z)，上海博泰實驗設備有限公司；超凈工作臺(SW-CJ-1F)，蘇泰集團蘇州安泰空氣技術有限公司；雙光束紫外可見分光光度計(TU-1901)，北京普析通用儀器有限責任公司；電子分析天平(FAZO04B)，上海精科儀器有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋(YXQ-LS-50S Ⅱ)，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；旋轉蒸發儀(R1001-VN)，鄭州長城科工貿有限公司；旋轉蒸發器(SY-5000)，上海亞榮生化儀器廠；循環水式多用真空泵(SHB-Ⅲ)，鄭州長城科工貿有限公司;恒流泵(BT100-2J)，保定蘭格；電腦全自動部分收集器(DBS-100)，上海滬西儀器分析廠有限公司；核磁共振波譜儀(AVANCEⅢ-400MHz)，瑞士布魯克；傅里葉光譜掃描儀(Prestige-21)，日本島津公司；高效液相色譜儀(UltiMate3000)，戴安中國有限公司；液相色譜質譜聯用儀(H-CLASS,G2XS)，Waters；氮吹儀(TTL-DCI)，北京同泰聯科技發展有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 類胡蘿卜素發酵液的制備

將0.4%種子發酵液接種于100 mL R2A培養基中，調pH值至6.5、搖床轉速100 r/min、溫度28 ℃，培養96 h。

1.3.2 類胡蘿卜素的提取

采用有機溶劑提取法，1 L發酵液于8 000 r/min離心10 min后搜集菌體沉淀。以90%乙醇為提取劑、料液比7∶50(g∶mL)、室溫下提取30 min后，8 000 r/min離心10 min，以獲得上清色素提取液。隨后采用減壓真空法將紅色素在45 ℃的水浴中濃縮至干，再將色素復溶于4 mL甲醇溶液中，以8 000 r/min離心10 min以近一步除去菌體，從而得到色素粗提液。

1.3.3 類胡蘿卜素的純化

1.3.3.1 薄層層析(TLC)

將色素粗提液點樣于薄層層析板上，后將其放置于裝有展開劑的層析缸中進行展開，當展開劑展開至距層析板2 cm處取出，此時樣品組分會因移動速度不同而發生分離[9]。由于樣品本身有顏色故無需噴顯色劑可直接通過顏色判斷分離情況，最終用比移值Rf來表示被分離物質在薄層板上的位置，Rf=物質本身移動距離/溶劑前沿移動距離。展開劑體系的選擇如表1所示。

表1 類胡蘿卜素粗提液TLC展開劑的選擇Table 1 Selection of TLC expansion agent for carotenoidcrude extract

1.3.3.2 柱層析

稱取50 g柱層析硅膠于110 ℃活化2 h，加入展開體系中極性較低的溶劑，體積約為干硅膠體積的1倍，用玻璃棒充分攪拌后浸泡沉淀12 h，再用玻璃棒混合成硅膠勻漿裝入60×3 cm的層析柱中，利用層析系統中低極性溶劑平衡柱子，待柱中硅膠沉淀緊實、且無氣泡后再用層析溶劑平衡柱子1～2個體積，最后進行上樣(4 mL類胡蘿卜素粗提液)，流速1 mL/min，以自動接收器每4 min接收1管，最后以顏色區別各洗脫液，以組分管數為X、吸光度值OD478為Y軸作圖，以及對含色素管進行TLC檢驗來判斷其是否良好分開[10]。依據TLC所選展開劑進行柱層析洗脫劑的選擇，洗脫劑試驗體系如表2所示。

1.3.4 類胡蘿卜素的鑒定

1.3.4.1 類胡蘿卜素溶解性

取少量被純化后氮吹干的類胡蘿卜素固體，分別溶于1 mL的水、甲醇、乙醇、丙酮、正庚烷、石油醚、乙酸乙酯中，觀察其溶解情況。

表2 類胡蘿卜素粗提液柱層析洗脫劑的選擇Table 2 Selection of column chromatograph eluent forcarotenoid crude extract

1.3.4.2 HPLC

經過預實驗確定HPLC條件為：PDA檢測器、反向C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)、流動相為A(甲醇)∶B(水)=95∶5(V∶V)；檢測波長478 nm；流速1 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量20 μL。

1.3.4.3 傅里葉紅外光譜掃描

將KBr與氮吹干的10 mg樣品進行混合壓片，并以KBr空白壓片作為參比進行傅里葉紅外光譜掃描。

1.3.4.4 核磁共振氫譜

稱取5 mg樣品溶解于CDCL3，并立即轉移至核磁管中，將核磁共振管擦拭干凈，置于核磁共振波譜儀中進行測定。

1.3.4.5 Q-TOF-HPLC-MS-MS

色譜儀WATERS UPLC-Q-TOF-MS，檢測器ACQUITY的ESI的正離子模式，分析柱：ACQUITY BEH C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，流動相A水(0.1%甲酸)∶B乙腈，梯度洗脫，0～0.5 min 40%B、0.5～3.0 min 50%B、3～4.5 min 55%B、4.5～8.5 min 70%B、8.5～13.8 min 100%B，進樣量1 μL，流速0.2 mL/min，毛細管電壓3 000 V，錐孔電壓40 V，脫溶劑氣溫度400 ℃，離子源溫度120 ℃，脫溶劑氣流速800 L/h，錐孔氣體流量50 L/h，質量范圍m/z100～1 000。

1.3.5 類胡蘿卜素抗氧化活性檢測

1.3.5.1 ABTS法

1.3.5.2 FRAP法

取0.1 mL 20 μg/mL的色素-80%甲醇溶液加入4.9 mL FRAP試劑，避光反應10 min后在波長593 nm測定吸光度值，空白加0.1 mL 80%甲醇替代提取液，吸光度值越大表示抗氧化能力越強。FRAP溶液配制:0.1 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(pH=3.6)∶10 mmol/L TPTZ(溶于40 mmol/L HCl)∶20 mmol/L FeCl3.6H2O=10∶1∶1(V∶V∶V)[11]。

1.3.5.3 DPPH法

1.4 數據分析

采用Microsoft Office Excel 2013進行數據統計，將平行3次的實驗結果以平均值±標準差的形式表示，以Origin 8.6專業函數繪圖軟件繪制實驗結果。

2 結果與分析

2.1 類胡蘿卜素的純化

薄層層析(TLC)是根據相似相溶原理發展起來的色譜分離技術，通過某一物質的吸附、溶解或親和性能的不同，隨著展開劑的不斷遷移混合物在不斷吸附和分配等作用下而分離，是快速分離和定性分離少量物質的重要技術[12]。一般認為合適的TLC展開系統是被分離物質的Rf不宜過大或過小，且展開后可較好判斷各成分的分離情況。

從表3可知，以正庚烷和丙酮為展開劑時效果較好，當配比為7∶3、6∶4、1∶1、4∶6時色素均可分離為2條條帶，其中當配比為1∶1時Rf分別是0.428和0.500，更適宜作展開劑；當展開劑為正己烷∶丙酮=6∶4時，Rf分別是0.692和0.615，但2條色素帶呈現拖尾現象，當其配比為3∶7時，Rf值過大不適合作為展開體系；二氯甲烷∶甲醇系統雖也有合適的Rf值，但條帶變為黃色且極易消失。因此，綜合選取正庚烷∶丙酮=1∶1為展開劑，Rf分別為0.428和0.500(如圖1)。

表3 TCL展開劑篩選結果表Table 3 TCL expansion agent screening result

圖1 TLC展開圖
Fig.1 TLC expansion diagram

硅膠層析法是根據不同物質在硅膠上的吸附力不同而將其分離，一般情況下極性較大的物質易被硅膠吸附，極性較弱的物質不易被硅膠吸附，整個層析過程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸過程[13]。柱層析的洗脫劑是依據薄層層析展開劑的配比和極性進行篩選，由表4可知，正庚烷∶丙酮=1∶1的體系可將類胡蘿卜素分為2條條帶，由圖2可知色素形成2個峰，23～31管和36～53管，其中36～53管之間的色素含量多，在波長478 nm其吸光度值最大，可以達到1.0左右，經過TLC驗證可以看出2種色素組分被良好地分開了(如圖3)。

表4 類胡蘿卜素柱層析洗脫劑篩選結果Table 4 Screening results of carotenoid columnchromatography eluant

圖2 類胡蘿卜素柱層析洗脫液紫外-可見
光譜檢測值
Fig.2 Carotenoid column chromatograph eluent UV
visible spectrum detection value

圖3 柱層析后TLC展開圖
Fig.3 TLC expansion after column chromatography

2.2 類胡蘿卜素組分的鑒定

類胡蘿卜素粗提液經純化后獲得2種組分，即組分1和組分2。由于組分1含量較少，因此只對組分2進行結構鑒定。

2.2.1 純化后類胡蘿卜素溶解性

從表5可知，該色素不溶于水、微溶于丙酮、甲醇、乙醇，易溶于正庚烷、石油醚、乙酸乙酯，表明該色素為脂溶性色素，且極性相對較小。這與黃水英報道的雨生紅球藻中蝦青素溶解性基本一致[14]。

表5 純化后類胡蘿卜素溶解性表Table 5 Purified carotenoid solubility

注：“-”表示不溶解；“+”表示易溶解。

2.2.2 純化后類胡蘿卜素HPLC檢測

由圖4可知，雖已對色素進行純化處理，但類胡蘿卜素中依舊至少存在4種成分，4種類胡蘿卜素的極性相差不大，應該為結構類似的一類物質。造成這一現象的原因，一方面可能是幾種極性和結構類似的物質構成了這一組分，另一方面可能是類胡蘿卜素不穩定而產生的降解產物，類胡蘿卜素分子中含有很長的不飽和雙鍵，末端可能還存在不飽和的酮基或羥基，故分子較為活潑易氧化分解[15]。

圖4 純化后類胡蘿卜素的HPLC檢測圖
Fig.4 HPLC detection of carotenoid after purification

2.2.3 純化后類胡蘿卜素的傅里葉紅外光譜掃描

圖5 純化后類胡蘿卜素的傅里葉紅外光譜掃描圖
Fig.5 Fourier infrared spectrogram of carotenoid after purification

2.2.4 純化后類胡蘿卜素的核磁共振氫譜

圖6 純化后色素的核磁共振氫譜檢測圖
Fig.6 Nuclear magnetic resonance hydrogen spectrum of
purified pigment after purification

2.2.5 純化后類胡蘿卜素的UPLC-Q-TOF-MS-MS檢測

依據UPLC-Q-TOF-MS的色譜圖選取出峰較高、吸光度值為478 nm的色譜峰進行質譜分析。結果如圖7所示。

由圖7-A可知，其中一種成分(即成分1)的一級質譜MS出現了m/z615.583 1、309.299 5、308.300 1的特征離子，其中m/z615.583 1為基峰，推測m/z615.583 1離子為[M+Na]+的離子峰，即M為592，而沒有看到其準分子離子峰m/z593[M+H]+。二級質譜MS-MS出現了m/z309.295 9、308.296 5等主要的離子碎片峰，m/z309.295 9離子峰來源可能是該物質裂解產生的C21H25O2·碎片，m/z308.300 1是其失去1個H而產生的碎片。由圖7-B可知，另一種組分(即成分2)的基峰為m/z619.614 6[M+Na]+，即該物質的分子量M為596，m/z310.311 3為該物質裂解產生的C21H26O2·碎片。結合溶解性、最大吸收波長、FRIT和1H-NMR，可知組分2的物質中含有多烯長鏈、多個甲基和亞甲基、苯環、羰基等特征結構，查閱文獻可知，圖7-A物質的分子式可能是C40H48O4，可能為蝦紅素(astacen)，其結構式如圖8所示。圖7-B的分子式為C40H52O4，可能為蝦青素(astaxanthin)，結構式如圖9所示[16]。

據程紅艷等[17]研究表明，采用反相高效液相色譜-電噴霧電離質譜法(RP-HPLC-DAD-ESI-MS)測定含氧類胡蘿卜素葉黃素分子量和裂解規律時發現，其電噴霧一級質譜特征離子為m/z589、306，其中m/z589 為其基峰，根據質量數確定m/z589 離子是[M+Na-2H]+離子峰，而葉黃素分子離子峰m/z568[M]+信號十分微弱，沒有看到準分子離子峰m/z569[M+H]+，說明采用電噴霧質譜分析葉黃素不易產生分子離子峰和準分子離子峰，易產生[M+Na-2H]+離子峰。另外，二級質譜特征離子確定m/z306([M+Na -C20H28O -H]+)峰為m/z589([M+Na-2H]+)離子峰的碎片峰。本試驗所得的含氧類胡蘿卜素在電噴霧電離質譜(ESI)下也基本符合RITA FRASSANITO所報道的蝦青素裂解規律[16]和程紅艷報道的葉黃素裂解規律[17]。

A-組分二中成分1；B-組分二中成分2圖7 純化后類胡蘿卜素的UPLC-Q-TOF-MS-MS檢測圖Fig.7 UPLC-Q-TOF-MS-MS detection of carotenoids after purification

圖8 Astacen的結構式
Fig.8 Structure of Astacen

圖9 蝦青素的結構式
Fig.9 Structure of astaxanthin

2.3 類胡蘿卜素抗氧化活性的檢測

體內抗氧化的研究即動物實驗不僅昂貴、耗時，且不適合初期大量篩選，但體外抗氧化測定具有簡單快速的特點而被廣泛使用[11]。體外評價抗氧化活性時若僅用1種方法不具有代表性和說服力，而常常選用3種方法進行評價[18]。因此，本文選取ABTS(評價自由基清除率)、FRAP(評價總還原力)、DPPH(評價自由基清除率)3種方法進行色素抗氧化活性評價，ABTS和DPPH方法中吸光度值越小抗氧化活性越強，但FRAP法是吸光度值越大抗氧化活性越強。從表7可以看出類胡蘿卜素粗提液以ABTS法和DPPH測定的吸光度值(0.300 5和1.174 0)均低于CK(0.627 0和1.324 5)，自由基清除率分別為55.32%和11.36%，表明色素具有抗氧化活性；FRAP法檢測色素粗提液的吸光度值(0.210 0)高于CK(0.085 0)，也表明色素具有抗氧化活性。

表7 類胡蘿卜素抗氧化活性檢測Table 7 Carotenoid antioxidant activity detection

因此。經過3種方法檢測評價類胡蘿卜素粗提液均具有抗氧化性。由表7可知，除ABTS法測定外，經純化后的類胡蘿卜素抗氧化活性顯著提高，以FRAP法評價時，類胡蘿卜素組分1抗氧化活性較類胡蘿卜素為粗提液的7.23倍，類胡蘿卜素組分2抗氧化活性為粗提液的7.79倍；以DPPH法評價時，類胡蘿卜素組分1抗氧化活性為粗提液的5.52倍，類胡蘿卜素組分2抗氧化活性為粗提液的5.48倍，表明經過柱層析純化后類胡蘿卜素的純度大大提高，其抗氧化活性也顯著提高。據報道，由于蝦青素結構中存在很長的不飽和雙鍵，末端還存在不飽和的酮基和羥基，因而具有較強的抗氧化活性[15]。

3 結論與討論

本試驗以魯氏不動桿菌UL所產類胡蘿卜素為原料，采用TLC和柱層析對類胡蘿卜素粗提液進行純化，試驗得出TLC最佳展開條件為正庚烷∶丙酮=1∶1，得到2條紅色條帶，其Rf分別為0.428和0.500；柱層析最佳的洗脫條件為流速1 mL/min、上樣量4 mL、洗脫劑正庚烷∶丙酮=1∶1、每隔4 min接收1管，該體系可將類胡蘿卜素分為2種組分，分別為組分1和組分2。將純化后的組分2進行溶解性、HPLC、FRIT、1H-NMR以及UPLC-Q-TOF-MS-MS等檢測和分析，結果表明組分2中含有多烯長鏈、多個甲基和亞甲基、苯環、羰基等類胡蘿卜素特征結構，查閱文獻推斷其是蝦紅素(astacen)，分子式C40H48O4，分子量592，以及含量相對較少的蝦青素，分子式C40H52O4，分子量596。試驗采用ABTS、FRAP、DPPH 3種方法評價了類胡蘿卜素粗提液和純化后類胡蘿卜素組分1、組分2的抗氧化活性，試驗結果表明類胡蘿卜素粗提液具有抗氧化性，純化后類胡蘿卜素的抗氧化活性顯著提高。

本試驗雖已對類胡蘿卜素進行了純化，但純度還能進一步提高。下一步研究可采用制備柱色譜對類胡蘿卜素進行純化，以獲得純度更高的類胡蘿卜素。類胡蘿卜素具有極高的經濟價值，若能實現其工業化生產，不僅能為類胡蘿卜素的應用提供新的思路和前提條件，而且能夠增加類胡蘿卜素的應用價值，更好地創造經濟效益。因此，認為魯氏不動桿菌(AcinetobacterlwoffiiUL)產類胡蘿卜素能否或如何應用于工業化生產亟待研究。