游離二氧化硫與葡萄酒氧化褐變及氧化還原電位的相關(guān)性分析

蘇昊，何志剛，李維新*，任香蕓，林曉姿，林曉婕,梁璋成

1(福建省農(nóng)產(chǎn)品(食品)加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州，350013) 2(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所，福建 福州，350003)

氧化褐變是葡萄酒生產(chǎn)過程中極易發(fā)生的重要問題之一，當(dāng)葡萄酒與氧過度接觸后，酒體通常會(huì)被氧化成褐色，并伴有令人不愉快的氧化味，導(dǎo)致葡萄酒品質(zhì)下降。同時(shí)還容易造成葡萄酒中有害好氧微生物的生長(zhǎng)繁殖，產(chǎn)生醋酸等對(duì)酒體風(fēng)味質(zhì)量不利的代謝產(chǎn)物[1-2]。影響葡萄酒氧化褐變的因素有氧氣、酚類、黃酮類、SO2、抗壞血酸、金屬離子等[3-5]，其中氧氣含量的影響起著決定性的作用。雖然少量的氧氣對(duì)葡萄酒具有一定的陳釀熟化作用，但過量的氧氣會(huì)導(dǎo)致酒體的過度氧化[6-8]，因此避免葡萄酒與氧氣過度接觸是控制葡萄氧化褐變的有效手段。

目前葡萄酒生產(chǎn)中防止氧化褐變的方法主要有滿罐貯藏、填充氮?dú)狻⑻砑覵O2、適度降低貯藏溫度等，其中SO2的應(yīng)用最為廣泛。SO2在較低濃度的情況下即具有抗菌、抗氧化、抗酶等多種作用[9-10]。一些研究學(xué)者嘗試通過脈沖電場(chǎng)、高壓和超聲波等物理方法或添加羥基酪醇等天然物質(zhì)來替代SO2，但效果均無法與SO2相比擬[11-12]。SO2在葡萄酒中主要以游離態(tài)和結(jié)合態(tài)2種形式存在，但起到抗氧化作用的主要是游離態(tài)的SO2，有效防止葡萄酒氧化的游離SO2含量通常為20～40 mg/L[13-14]。葡萄酒中添加過量的SO2對(duì)人體有害，國(guó)際葡萄酒組織(International Vine and Wine Organization，OIV)及我國(guó)葡萄酒國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定，葡萄酒中游離SO2的含量不得高于50 mg/L，因此在葡萄酒加工中如何正確適量使用SO2極其重要。氧化還原電位(oxidation-reduction potential，ORP)作為能夠反映葡萄酒中氧化還原能力的綜合性指標(biāo)，其變化有助于了解葡萄酒的電化學(xué)性質(zhì)，分析葡萄酒的氧化進(jìn)程，而葡萄酒中SO2的含量也影響著其ORP[15]，且ORP可以實(shí)現(xiàn)在線監(jiān)測(cè)。本研究以桂葡1號(hào)葡萄酒和刺葡萄酒為對(duì)象，分析不同游離SO2含量的酒樣在加速氧化褐變過程中游離SO2、褐變程度、ORP的變化，并探討游離SO2、氧化褐變與酒中ORP之間的關(guān)系，研究游離SO2含量對(duì)葡萄酒氧化褐變的抑制作用，通過ORP的監(jiān)測(cè)預(yù)警葡萄酒的氧化褐變，可為葡萄酒加工中減少使用SO2提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葡萄酒：福建省農(nóng)產(chǎn)品(食品)加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研發(fā)的桂葡1號(hào)葡萄酒(2016年生產(chǎn))和刺葡萄酒(2015年生產(chǎn))，試驗(yàn)酒樣的主要理化指標(biāo)如表1所示。

儀器：去極化自動(dòng)氧化還原電位測(cè)定儀(FJA-6型)，南京傳滴儀器設(shè)備有限公司;酸度計(jì)(868型)，ORION；紫外可見分光光度計(jì)(島津UV-1750)，日本島津公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

檸檬酸、Na3PO4、NaOH、葡萄糖、亞硫酸等均為分析純，其中亞硫酸的SO2含量≥6.0%。

表1 試驗(yàn)酒樣的主要理化指標(biāo)Table 1 Main physicochemical indexes of wine samples

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酒樣的加速氧化褐變方法

參考SIOUMIS等的方法[16]，并經(jīng)過調(diào)整：2種葡萄原酒在原有游離SO2含量的基礎(chǔ)上，分別按體積分?jǐn)?shù)為0、0.5、1.0、1.5 mL/L添加亞硫酸，制成含不同游離SO2的酒樣，之后于250 mL的玻璃瓶中加入200 mL不同處理葡萄酒樣，加蓋密閉，置于(40±1)℃恒溫干燥箱中避光處理49 d。每個(gè)樣品設(shè)3次重復(fù)，第1、2、3、7天分別取樣1次，之后每7 d取樣1次，取樣置于20 ℃恒溫箱中恒溫2 h后，分別檢測(cè)酒樣的褐變程度、游離SO2、ORP。其中：桂葡1號(hào)葡萄酒按游離SO2含量從低到高標(biāo)號(hào)分別為A11：9.32 mg/L，A2：39.02 mg/L，A3：58.16 mg/L，A4：78.56 mg/L；刺葡萄酒標(biāo)號(hào)為B1：29.02 mg/L，B2=29.02 mg/L，B3：48.16 mg/L，B4：66.78 mg/L。

1.2.2 酒樣褐變程度的測(cè)定

以波長(zhǎng)420 nm下的吸光值表示葡萄酒的褐變程度。酒樣在測(cè)定前經(jīng)過0.45 μm有機(jī)相針式過濾，用檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖溶液稀釋10倍。光程1 cm的石英比色皿中利用紫外-可見光分光光度計(jì)測(cè)定。檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖溶液的配制：將75 mL 0.05 mol/L的檸檬酸與25 mL 0.1 mol/L的磷酸鈉進(jìn)行混合，每次現(xiàn)配現(xiàn)用，使用前經(jīng)過0.45 μm有機(jī)相針式過濾。

1.2.3 酒樣理化指標(biāo)的檢測(cè)

游離SO2、酒度、揮發(fā)酸、總酸、還原糖、pH的測(cè)定，參照王華《葡萄酒分析檢驗(yàn)》[17]。

ORP測(cè)定：自動(dòng)氧化還原電位測(cè)定儀測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用數(shù)據(jù)處理軟件DPS(V 7.05)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄酒加速氧化過程中游離SO2含量的變化

在葡萄酒的加速氧化過程中，SO2逐漸被消耗，在氧化的第1天，2種葡萄酒的游離SO2迅速下降，桂葡1號(hào)葡萄酒4個(gè)處理的游離SO2分別下降了27.01%、49.26%、55.56%和50.47%；刺葡萄酒中4個(gè)處理的游離SO2分別下降了51.27%、49.17%、62.58%和58.36%。到加速氧化的第7天，2種葡萄酒所有處理的游離SO2都降低到5.22 mg/L以下，之后，基本維持在3.92 mg/L的狀態(tài)，雖然游離SO2不能完全被消耗掉，但已經(jīng)很難表現(xiàn)出抗氧化作用(圖1，2)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，即使葡萄酒中含有較高濃度的游離SO2，在較高的溫度(40 ℃)、罐內(nèi)空氣殘留較多的情況下，仍然會(huì)被快速氧化消耗。

圖1 桂葡1號(hào)葡萄酒氧化過程中游離SO2的變化
Fig.1 Changes of free sulfur dioxide during the oxidation
of Guipu-1 wine

圖2 刺葡萄酒氧化褐變過程中游離SO2的變化
Fig.2 Changes of free sulfur dioxide during the oxidation
of brier wine

2.2 游離SO2含量對(duì)葡萄酒氧化褐變的影響

在加速氧化的前21 d，不同硫含量的桂葡1號(hào)葡萄酒的氧化褐變程度均顯著快速增加，褐色素大量形成；21 d之后，變化趨于平緩，有少量下降趨勢(shì)，表明褐色素形成變緩或下降(圖3)。在加速氧化的0～7 d，各處理褐變程度與氧化時(shí)間成正相關(guān)(P<0.05)，線性斜率分別為：KA1=0.014 5>KA2=0.013 5>KA3=0.014 0>KA4=0.010 3，表明起始游離SO2含量越高，其氧化褐變的程度越低。各處理間在0～7 d褐變程度的差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，14 d之后各處理的游離SO2含量維持在3.92 mg/L，各處理間褐變程度差異不顯著(P>0.05)。刺葡萄酒在整個(gè)氧化過程中，其褐變程度一直呈上升趨勢(shì)，也符合起始游離SO2含量越高氧化褐變的程度越低的規(guī)律(圖4)。試驗(yàn)結(jié)果表明，葡萄酒中起始游離SO2越高，其氧化褐變程度越低；當(dāng)葡萄酒中游離SO2含量較低時(shí)(3.92 mg/L)，其抗氧化作用基本消失。因此，在葡萄酒的加工中，僅僅靠添加SO2，而沒有綜合考慮隔氧、低溫貯藏等有效手段，仍然避免不了葡萄酒被過度氧化褐變的現(xiàn)象發(fā)生。

圖3 不同硫含量的桂葡1號(hào)葡萄酒的氧化褐變
Fig.3 Oxidative browning of Guipu-1 wine with different sulfur content

圖4 不同硫含量的刺葡萄酒的氧化褐變
Fig.4 Oxidative browning of brier wine with different sulfur content

2.3 葡萄酒氧化褐變過程中ORP的變化及與游離SO2的關(guān)系

葡萄酒在正常的游離SO2含量(20～50 mg/L)情況下，其ORP在330～390 mV范圍內(nèi)，在葡萄酒加速氧化過程中，2種葡萄酒的ORP在7 d前快速增加，所有處理的ORP均上升到450 mV左右。ORP快速上升可能有2個(gè)方面的原因：一是能降低葡萄酒ORP的游離SO2迅速被消耗，二是葡萄酒中的酚類物質(zhì)被氧化為鄰醌，并伴隨H2O2的生成，ORP表現(xiàn)為快速上升。在7 d后，2種葡萄酒的ORP保持較為穩(wěn)定的高水平，因?yàn)槠咸丫浦械姆宇愇镔|(zhì)減少，自由基生成減弱或消失，氧化反應(yīng)減退，ORP變化緩和。到氧化的后期，隨著氧化的進(jìn)行，聚合物越來越大，一些褐色素會(huì)沉淀下來，褐變程度略微下降(圖5，6)。

圖5 桂葡1號(hào)葡萄酒的氧化褐變過程中ORP的變化
Fig.5 Changes of ORP during oxidative browning of
Guipu-1 wine

圖6 刺葡萄酒的氧化褐變過程中ORP的變化
Fig.6 Changes of ORP during oxidative browning of brier wine

在較高游離SO2存在的情況下，同一種葡萄酒游離SO2含量是影響葡萄酒ORP的主要因素。在加速氧化過程中，不同游離SO2含量的桂葡1號(hào)葡萄酒和刺葡萄酒的游離SO2與ORP均呈極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.01)：不同起始游離SO2的桂葡1號(hào)葡萄酒，其游離SO2(Y)與ORP(X)回歸方程分別為：YA1=81.663-0.168XA1(R=0.947 5)，YA2=126.154-0.270XA2(R=0.947)，YA3=159.779-0.347XA3(R=0.926)，YA4=190.792-0.422XA4(R=0.923)；刺葡萄酒二者之間的回歸方程分別為：YB1=36.425-0.071XB1(R=0.876)，YB2=88.129-0.182XB2(R=0.978)，YB3=99.420-0.209XB3(R=0.913)，YB4=122.036-0.261 1XB4(R=0.957)。葡萄酒的品種和起始游離SO2含量不同，其游離SO2含量與ORP的回歸方程各不相同，但其相關(guān)性的趨勢(shì)是一致的。試驗(yàn)結(jié)果表明葡萄酒的ORP的變化可以間接反映出游離SO2含量的變化，因此，可以通過監(jiān)測(cè)葡萄酒中ORP含量來預(yù)警葡萄酒的氧化褐變程度。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)在250 mL玻璃瓶中裝入200 mL的酒樣并密閉，試驗(yàn)開始的時(shí)候，瓶中含有豐富的氧，因此雖然有一定濃度的游離SO2存在，但葡萄酒仍然被急速氧化。有研究表明，在規(guī)定SO2添加量的前提下，葡萄酒中的某些酚類物質(zhì)比SO2吸收及消耗氧更快，SO2的抗氧化作用是與氧化的中間產(chǎn)物鄰醌和H2O2的反應(yīng)[18-20]。因此在加速氧化的前期(前7 d)，桂葡1號(hào)葡萄酒和刺葡萄酒的SO2都迅速下降，其褐變程度快速上升，但起始游離SO2含量較高的處理，其抗氧化能力越強(qiáng)，葡萄酒的褐變程度越小。7 d之后，游離SO2的含量一直保持較低的水平，雖然其含量不會(huì)被完全消耗掉，但已經(jīng)很難表現(xiàn)出抗氧化的能力，此時(shí)葡萄酒中的可被氧化的物質(zhì)較少，葡萄酒的氧化褐變程度變化也較小。研究結(jié)果表明SO2雖然對(duì)葡萄酒具有較好的抗氧化作用，但葡萄酒在高溫(40 ℃)和高氧(非滿罐貯藏)的情況下，仍然避免不了被氧化損失。因此，在葡萄酒的加工及貯藏期間，保持適宜的游離SO2含量(通常為20 ～40 mg/L)并結(jié)合低溫和隔氧貯藏是防治葡萄酒被過度氧化的關(guān)鍵措施。

在葡萄酒中存在多種氧化還原電對(duì)，構(gòu)成復(fù)雜的氧化還原體系，而其ORP是多種氧化物質(zhì)與還原物質(zhì)發(fā)生氧化還原反應(yīng)的綜合結(jié)果[21-22]。作為能夠反映葡萄酒中氧化還原能力的綜合性指標(biāo)，ORP的變化，有助于了解葡萄酒的電化學(xué)性質(zhì)，分析葡萄酒的氧化進(jìn)程。影響葡萄酒的ORP的因素較多，包括游離SO2、pH值、離子、溫度、酒的品種等等[23-24]。本研究結(jié)果表明，在南方山葡萄酒加速氧化過程中，其ORP在前期急速增加，后期趨于緩和，其變化與酒中游離SO2的含量密切相關(guān)。對(duì)起始游離SO2含量不同的葡萄酒在加速氧化過程中ORP與游離SO2的變化分析表明，游離SO2含量與ORP呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。因影響葡萄酒的ORP的因素較多，在進(jìn)行葡萄酒游離SO2和ORP相關(guān)研究時(shí)，要考慮酒的品種及初始添加的游離SO2含量，在同一品種同一批產(chǎn)品貯藏時(shí)，事先建立二者之間的回歸方程，然后通過葡萄酒中ORP的變化實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)游離SO2的變化和葡萄酒的氧化程度。葡萄酒在正常的游離SO2含量情況下，其ORP為330～390 mV，如其含量快速上升，預(yù)示其有被氧化的風(fēng)險(xiǎn)，若上升至450～460 mV，則可以確定該葡萄酒中游離SO2含量較低，葡萄酒已經(jīng)被過度氧化。ORP的檢測(cè)方便快捷，并能實(shí)現(xiàn)在線監(jiān)測(cè)，因此，深入研究葡萄酒中游離SO2的含量與ORP之間的關(guān)系，明確其影響因素，對(duì)于利用ORP來快速監(jiān)測(cè)葡萄酒中游離SO2含量(或范圍值)，減少葡萄酒中過度添加SO2，實(shí)現(xiàn)葡萄酒數(shù)字化、智能化加工，并對(duì)葡萄酒的過度氧化的有效預(yù)警有著重要的研究意義。