酶解黃酒糟對料酒發酵的影響

劉姍，楊柳*，何述棟，孫漢巨，姚升飛，徐尚英

1 (合肥工業大學 食品科學與工程學院，安徽 合肥，230009)2 (安徽海神黃酒集團有限公司，安徽 廬江，231561)

料酒是專門用于烹飪調味的酒，具有去腥、增香、殺菌等功效，在我國使用歷史悠久。啤酒、白酒、黃酒等均能作為料酒，但以半干黃酒為料酒時烹飪效果最佳[1]。黃酒是以大米、小米等谷物為原料，經過麥曲、酒曲中多種微生物的糖化、發酵釀制而成[2]。飲用黃酒多以糯米為主要原料進行生產，而烹飪黃酒(即料酒)生產原料主要是粳米。黃酒糟是發酵醪經壓榨、澄清、過濾得到的固體殘渣，每100kg大米經發酵產生約20～30kg黃酒糟[3]。新鮮黃酒糟主要含有原料中未分解利用完全的蛋白質和淀粉、酵母、乙醇及發酵過程中產生的風味物質[4]。對黃酒糟的綜合利用研究主要集中在調味品的開發上，如食醋[5]、醬油[6]等；將黃酒糟用于黃酒生產的研究主要集中在代替部分小麥制曲[2]、代替部分大米制酒[7]等方面。本課題組在前期實驗中發現將黃酒糟和米飯混合發酵生產料酒時，盡管料酒中氨基酸態氮含量有一定增加，但是出糟率較高，黃酒糟沒有被充分利用，特別是黃酒糟中的蛋白質。黃酒糟蛋白質主要是由難溶的米谷蛋白和酵母蛋白組成，為了提高黃酒糟蛋白的溶出率，多利用蛋白酶對其進行處理[8]；米谷蛋白在蛋白酶作用下，蛋白溶出率明顯增加；而酵母細胞壁蛋白質含量低，直接用蛋白酶處理酵母蛋白的溶出率低，從而限制了黃酒糟蛋白的利用。

黃酒釀造一般需要使用麥曲作為糖化劑，麥曲對產品的鮮味起著決定作用，但麥曲的制作受氣溫、原料等因素影響，使其質量不受控制[9]。許多料酒生產企業嘗試減少麥曲的使用量，但這樣會降低產品的鮮味，表現在理化指標上是氨基酸態氮含量較低[10]。

為了改善料酒品質，提高黃酒糟的利用價值，本論文對黃酒糟進行酶解研究，考察了酶解物添加形式對料酒發酵的影響，以達到提高料酒中氨基酸態含量的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

粳米、黃酒糟，安徽海神黃酒集團有限公司；KCl、葡萄糖、甲醛、NaOH、無水乙醇、濃硫酸(均為分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；水合茚三酮(99.9%)，美國Sigma-Aldrich公司；釀酒曲(紹興風味)、安琪釀酒高活性干酵母(黃酒專用)，安琪酵母股份有限公司；堿性蛋白酶(2×105U/g)、木瓜蛋白酶(1×105U/g)、酸性蛋白酶(1×105U/g)、β-葡聚糖酶(1×104U/g)、中性蛋白酶(1×105U/g)，北京奧博星生物技術有限公司；復合風味蛋白酶(1.3×105U/g)，南寧東恒華道生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

K9860全自動凱氏定氮儀、Hanon SH220N 石墨消解儀，濟南海能儀器股份有限公司；冷凍干燥機，北京博醫康實驗儀器有限公司；752N型分光光度計，上海第三分析儀器廠；SHY-2A水浴恒溫振蕩器，江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠；SHP-250型生化培養箱，上海三發科學儀器有限公司；KQ-400KD型高功率數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；S-4330D氨基酸分析儀，德國sykam公司。

1.3 方法

1.3.1 鮮黃酒糟中酵母質量分數的測定

準確稱取5.0 g鮮黃酒糟，加入100 mL無菌水，室溫下緩慢振蕩(60～80 r/min) 10 min，過60目篩網，收集濾液并適當稀釋，利用血球計數板對其中的酵母細胞數量進行計數。根據酵母數量和質量的關系(3.31±0.045)×1010個/g(干重)，計算出鮮黃酒糟中酵母所占的質量分數。

1.3.2 酵母菌懸液的制備

取YPD培養基培養48 h的酵母菌培養液，離心，棄上清，沉淀(菌泥)用蒸餾水洗滌3次，懸浮于無菌水中，酵母菌懸液濃度為(7.92±0.92)×108個/mL。

1.3.3 處理方式對酵母蛋白質溶出率的影響

取100 mL酵母菌懸液于三角瓶中，采用4種方式處理酵母細胞，其中KCl、β-葡聚糖酶添加量以酵母干重為基準。反應條件分別為：KCl處理組,KCl添加量分別0.03、0.06 g，50 ℃保溫振蕩(100～120 r/min) 12 h；β-葡聚糖酶處理組,β-葡聚糖酶添加量分別為6.0、12.0 mg，在pH 6.5、55 ℃下保溫12 h后，置于85 ℃水浴保持15 min滅酶活；超聲波處理組,在頻率40 kHz、40℃及功率300 W條件下，分別處理30、60 min；沸水浴處理組,在沸水浴中分別保溫5、10 min。各反應液經離心(5 000 r/min，10 min)得上清液。凱氏定氮法測定蛋白質濃度，計算酵母蛋白質溶出率。酵母蛋白質溶出率為反應后上清液中蛋白質含量與反應前體系中蛋白質含量的比值。

1.3.4 蛋白酶種類對黃酒糟蛋白酶解的影響

準確稱取2.0 g鮮黃酒糟，加40 mL無菌水混合均勻，經沸水浴處理5 min，冷卻后，分別添加中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶、復合風味蛋白酶、堿性蛋白酶，酶添加量以每克黃酒糟干重為基準，在各酶的最適溫度和pH條件下酶解2 h，酶解物經離心(5 000 r/min，10 min)得酶解液。甲醛滴定法測酶解液中氨基酸態氮含量，并計算出氨基酸態氮增量。氨基酸態氮增量即酶解后反應液中氨基酸態氮含量與酶解前反應體系中氨基酸態氮的差值。

1.3.5 黃酒糟酶解物的制備

準確稱取2.0 g鮮黃酒糟，加40 mL無菌水混合均勻，經沸水浴處理5 min，冷卻后，在堿性蛋白酶添加量為1 500 U/g(黃酒糟干重)、45 ℃、pH 10.0條件下保溫2 h，得黃酒糟酶解混合物。將此混合物離心(5 000 r/min，10 min)，上清液即為黃酒糟酶解液，沉淀為黃酒糟酶解殘渣。

1.3.6 料酒制備

取一定量的粳米，加入同等質量自來水(水質要求符合生活飲用水標準GB 5749—2006)，25℃浸泡48 h，瀝去水。取150.0 g浸泡后的粳米(干重約100.0 g)分裝于500 mL三角瓶中，加入80 mL自來水，包扎封口后，置于高壓滅菌鍋中，在0.05 MPa下保溫15 min進行蒸飯。向冷卻至28℃左右的米飯中加入0.2 g釀酒曲、0.2 g釀酒高活性干酵母和100 mL無菌水混合并攪拌均勻。在28 ℃下保溫培養，每隔4 h攪拌一次，培養5 d后在18 ℃下將繼續培養10 d，得到料酒發酵醪，將醪液離心，上清液即為料酒原酒液。

1.3.7 黃酒糟酶解物添加形式對料酒發酵的影響

在料酒發酵開始時，向米醪中分別添加經冷凍干燥的黃酒糟、黃酒糟酶解液、黃酒糟酶解殘渣、黃酒糟酶解混合物，添加量分別為3.0、5.0 g/L，待料酒發酵結束后，測定原酒液的酒精度、氨基酸態氮含量、出糟率。出糟率為發酵結束時酒糟干重占總投料干重的百分數。

1.3.8 黃酒糟酶解混合物添加量對料酒發酵的影響

黃酒糟酶解混合物添加量分別為1.0、2.0、4.0、8.0% (酶解前酒糟干重占總物料干重的百分數)，將其添加到米醪中進行料酒發酵，以料酒原酒液中的酒精度、出糟率、氨基酸態氮含量作為評價指標。

1.3.9 添加黃酒糟酶解混合物對料酒中游離氨基酸的影響

將黃酒糟酶解混合物以2.0 g/L添加量添加到米醪中進行料酒發酵，利用S-4330D氨基酸分析儀測定料酒原酒液中的游離氨基酸種類和含量。

1.4 測定方法

(1)蛋白質含量測定：按國家標準《谷類、豆類作物種子粗蛋白質測定法(GB/T 5511—2008)》進行。

(2)氨基酸態氮含量測定：參照GB/T 5009.235—2016 食品安全國家標準 食品中氨基酸態氮的測定。

(3)酒精度測定：蒸餾法[11]。

(4)游離氨基酸測定：參照GB/T 5009. 124—2003《食品中氨基酸的測定》進行。

1.5 數據處理

數據以平均值±標準偏差表示，采用SPSS 22.0 統計軟件進行數據分析，組間比較采用單因素方差分析中的Duncan法檢驗。

2 結果與分析

2.1 處理方式對酵母蛋白質溶出率的影響

黃酒糟中蛋白質含量和酵母含量因原料、生產工藝不同而存在一定差異。本實驗所用黃酒糟的粗蛋白含量為(51.12±2.65)%，酵母細胞的質量分數為(23.93±1.50)%左右，酵母蛋白的質量占酒糟粗蛋白的36.4%。酵母蛋白易被微生物利用，但酵母細胞細胞壁“三明治”式的結構使得酵母蛋白不易溶出。為了提高黃酒糟蛋白的溶出率和蛋白酶酶解黃酒糟的效率，需要破壞酵母細胞壁結構。破壞酵母細胞壁結構的方法較多，主要有KCl、超聲波、β-葡聚糖酶等[12-14]。實驗研究了4種處理方式對酵母蛋白溶出的影響，結果如表1所示。

表1 處理方式對酵母蛋白溶出率的影響Table 1 Effects of treatment methods on the dissolutionefficiency of yeast protein

注：*表示差異顯著；**表示差異極顯著。

由表1可知，4種處理方式均能促進酵母蛋白的溶出，沸水浴處理時酵母蛋白的溶出量和溶出率最大，且沸水浴處理對溶出率影響高度顯著，沸水浴處理10 min，酵母蛋白溶出率較對照組增加48.21%；采用β-葡聚糖酶處理酵母細胞對酵母蛋白的溶出率影響顯著，采用超聲波和KCl溶液處理酵母蛋白的溶出率較對照略有增加。考慮酵母蛋白溶出率和生產成本，選擇酵母蛋白提取方法為沸水浴處理5 min。

2.2 蛋白酶種類對黃酒糟酶解的影響

米谷蛋白不易被微生物利用，但經蛋白酶酶解后產生的水解蛋白易被生物轉化利用。用于酶解酒糟的蛋白酶主要有復合風味蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶等[8]。以酶解前后氨基酸態氮增量為指標，在各酶的最適反應條件下考察了中性蛋白酶、酸性蛋白酶、復合風味蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶5種蛋白酶對黃酒糟蛋白酶解效果的影響，結果如表2所示。

表2 蛋白酶種類對黃酒糟酶解的影響Table 2 Effects of protease kinds on enzymatichydrolysis of rice wine lees

注：不同小寫字母表示同一列處理組之間具有顯著差異性，下同。

由表2可知，添加蛋白酶對黃酒糟蛋白的水解影響顯著，且水解率均隨酶添加量的增加而有所提高。其中以堿性蛋白酶酶解效果最優，氨基酸態氮含量較反應前增加70.50%，與樓芳菲等[8]研究結果相似，這主要是因為黃酒糟中的堿溶蛋白(如米谷蛋白)含量較高[15]。因此，選擇堿性蛋白酶用于黃酒糟的酶解。

2.3 黃酒糟酶解物添加形式對料酒發酵的影響

黃酒糟經蛋白酶酶解后的反應體系為固液混合物，液體(黃酒糟酶解液)主要含有水溶蛋白、蛋白水解產物、風味成分等，固體(黃酒糟酶解殘渣)主要含有黃酒糟中的難溶蛋白質、淀粉及纖維素等。使用黃酒糟酶解體系的不同部分作為輔料添加至米醪中進行發酵會影響料酒的酒精度、氨基酸態氮含量及出糟率。分別以黃酒糟、黃酒糟酶解液、黃酒糟酶解殘渣、黃酒糟酶解混合物為輔料，研究其對料酒發酵的影響，結果如表3所示。

由表3知，添加黃酒糟酶解物的不同組分對料酒酒精度、出糟率、氨基酸態氮含量影響差異明顯，輔料以黃酒糟、黃酒糟酶解液、黃酒糟酶解殘渣的形式添加時，酒精度均有不同程度的降低，而添加黃酒糟酶解混合物時，酒精度較對照略有增加。直接添加黃酒糟出糟率最高，其次是添加黃酒糟酶解殘渣，因其中含有大量的不可溶固體，致使出糟率較高；添加黃酒糟酶解液料酒中出糟率較低，但氨基酸態氮含量增加不明顯，因酶解液中含氮類物質易被菌體利用。綜合考慮，選擇以黃酒糟酶解混合物的形式添加到米醪中進行料酒發酵。

表3 黃酒糟酶解物添加形式對料酒發酵的影響Table 3 Effects of rice wine lees hydrolysate additionform on cooking wine fermentation

2.4 黃酒糟酶解混合物的添加量對料酒發酵的影響

黃酒糟酶解混合物含有一定量的難溶物質，其添加量對料酒的酒精度、出糟率、氨基酸態氮含量有影響。添加量對料酒發酵的影響如表4所示。

表4 黃酒糟酶解混合物添加量對料酒發酵的影響Table 4 Effects of the rice wine lees enzymolysismixture content on cooking wine fermentation

由表4知，黃酒糟酶解混合物的添加量對酒精度影響不顯著；出糟率和酒液中氨基酸態氮含量均隨著黃酒糟酶解物添加量的增加而增加。成熟料酒酒液氨基酸態氮含量為0.521 g/L，較對照組提高了391.51%。GB/T 2745—2005烹飪黃酒質量標準中氨基酸態氮含量規定：優級烹飪黃酒為0.4 g/L左右，因此，選擇黃酒糟酶解混合物的添加量為2.0 g/L。

2.5 添加黃酒糟酶解混合物對料酒中游離氨基酸的影響

料酒中氨基酸主要來自于原料中蛋白質的分解及酵母、霉菌等微生物的自溶[8]，它與料酒的質量和風味有密切關系。向米醪中添加2.0%黃酒糟酶解混合物進行發酵，利用氨基酸分析儀測定料酒原酒液中游離氨基酸的種類和含量，并與未添加酒糟酶解物的料酒(對照組)比較，結果如表5所示。

表5 添加黃酒糟酶解混合物對料酒中氨基酸組成的影響Table 5 Effects of the rice wine lees enzymolysis mixtureon amino acids compostion in cooking wine

注：ND-未檢測;鮮味氨基酸，Glu和Asp;甜味氨基酸，Thr,Ser,Gly,Ala,Met和Cys;苦味氨基酸，Ile,Leu,Val,Phe,Lys,His和Arg;澀味氨基酸，Tyr

從表5可知，料酒中游離氨基酸種類較全面，含有蘇氨酸、甲硫氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸和苯丙氨酸7種人體必須氨基酸。氨基酸不僅賦予了料酒豐富的營養價值，而且具有良好的呈味作用，例如:甘氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸等呈甜味；天冬氨酸、谷氨酸具有鮮味；賴氨酸、組氨酸、亮氨酸、精氨酸等呈苦味；酪氨酸則呈澀味[16]。以黃酒糟酶解混合物為輔料制備的料酒中各種呈味氨基酸含量較對照組增加顯著，其中呈鮮味和甜味氨基酸含量總和較對照分別增加了0.348 g/L和0.703 g/L，而且氨基酸風味比值(鮮味和甜味氨基酸含量之和與苦味和澀味氨基酸含量之和的比值)較對照增加了62.35%，達到了0.690。料酒酒液總氨基酸含量較對照提高了404.69%。說明添加黃酒糟酶解物混合物有利于料酒中氨基酸含量的提升和料酒風味的改善。

3 結論

隨著黃酒產業不斷發展，黃酒生產過程中產生米漿水、黃酒糟及加工廢水等帶來的環境問題，已引起人們的關注。黃酒糟是黃酒企業生產黃酒的主副產物，盡管黃酒糟含有豐富的酵母、蛋白、淀粉等物質，但因含不溶性物質多，難以直接利用，對黃酒廠來說黃酒糟是廢棄物，一般只當飼料處理甚至是爛掉，造成黃酒糟中大量可利用資源的浪費。黃酒發酵過程中，微生物較易利用淀粉，而對原料谷物中米谷蛋白等難溶蛋白利用能力較差；黃酒發酵過程中還產生大量的釀酒酵母細胞，從而造成黃酒糟中蛋白含量較高。提高蛋白溶出率是黃酒酒糟資源化利用必須要解決的問題。黃酒糟蛋白在堿性條件下溶解度較高，前期實驗發現，pH 13.0時黃酒糟蛋白的溶出率是pH 7.0時的42倍。但因料酒發酵環境及料酒為弱酸性，因此，僅通過調節黃酒糟的酸堿度對提高微生物對蛋白質的利用效率幫助不大。已有研究表明[17]，通過蛋白酶酶解谷蛋白可以提高谷蛋白的溶解度。絕大多數的黃酒糟酶解研究沒有考慮谷蛋白和酵母蛋白的不同性質。本研究表明先對黃酒糟進行加熱處理再進行蛋白酶水解有助于蛋白質的溶出，該法簡單易行、成本低，具有很大的應用前景。

以黃酒糟酶解混合物為輔料進行料酒發酵，酶解混合物中含有易被微生物生長利用的胨、肽等蛋白質降解產物，添加到料酒發酵醪中，能促進菌體的生長，從而影響發酵醪中酒精和氨基酸態氮的含量。因黃酒糟富含蛋白質和風味物質，添加黃酒糟酶解混合物制備的料酒中氨基酸態氮和風味成分都比較豐富，從而可以彌補因少加麥曲造成的料酒中氨基酸態氮和風味的不足。黃酒糟酶解混合物的添加可以有效提高料酒中氨基酸態氮的含量，但對料酒中風味物質的種類、含量等影響還需進一步探究。