高效液相色譜法測定可可粉中可可殼含量

張九魁, 賈楠, 柯潤輝*,王爍, 李曉斌, 尹建軍

1(中國焙烤食品糖制品工業協會，北京，100083)2(中國食品發酵工業研究院有限公司，國家食品質量監督檢驗中心，北京，100015)

可可粉是采用直接加工處理方法從可可豆中得到的可可制品，是當今世界三大嗜好性飲料之一[1]。由于受到可可產地及產量的限制，可可粉原料供給不足，大量劣質或者假冒的可可粉開始出現在國內市場[2]。由于可可殼粉碎后從肉眼上難以與可可粉區別，一些不法企業以飼料名義進口可可殼，粉碎加工后噴上可可香精，然后摻到可可粉中，牟取暴利。此外，在可可粉的生產過程中，殘存可可殼的含量是可可粉質量控制的一個重要參數，也是歐美等發達國家可可粉貿易中的一個重要質量指標[3]。而目前國內的可可粉質量標準只是簡單地在感官和理化要求上做了規定[4]，對可可粉中可可殼含量沒有做出限量規定，尚沒有可行的檢測方法來鑒別。

鑒別可可粉中可可殼，最初是通過顯微鏡觀察識別石細胞，該方法操作較簡單，但較費時，且難以準確定量。金永生等[5]建立了PCR法，檢測可可粉中添加外源植物源性成分，但該方法易受雜質影響，且不能鑒別可可殼這種主要的內源性摻假物[2]。胡明華等[2]用HPLC-指紋圖譜結合系統聚類分析法可對摻入15%及以上可可殼的可可粉予以鑒別。但此方法也存在操作復雜，不便推廣等缺點。MEYER[6]發現，脂肪酸色酰胺類物質在可可殼中含量遠遠高于可可粉中含量，因此可用作指示物來鑒別可可粉中可可殼含量。基于這個原理，FINCKE和SACHER[7]開發了分光光度法測定可可粉中脂肪酸色酰胺濃度來計算可可殼含量，是目前國際可可、巧克力及糖果協會(International Office of Cocoa, Chocolate and Sugar Confectionary, IOCCC)官方檢驗方法[8]，但是這個方法的靈敏度相對較低。MüNCH等[9]建立了液相色譜分析脂肪酸色酰胺的方法，并嘗試將其用于測定市售巧克力產品中可可殼含量。基于上述研究結果，本文建立了固相萃取-高效液相色譜-熒光檢測器測定可可粉和可可殼中二十二烷酸色酰胺和二十四烷酸色酰胺的定量分析方法，再根據樣品中脂肪酸色酰胺含量與可可殼含量之間的對應關系，建立定量鑒別模型，對可可粉中可可殼含量進行定量分析鑒別。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試劑：乙腈、乙酸乙酯、正己烷(色譜純)，美國J.T.Baker公司；四氫呋喃(色譜純)，美國ThermoFisher公司)；三氯甲烷(分析純)，北京化工廠；實驗用水均為超純水。

標準品：二十二烷酸色酰胺(behenic acid tryptamide, BAT)、二十四烷酸色酰胺(lignocerinic acid tryptamide, LAT)(純度≥99%)標準品(均為固體)，美國Sigma-Aldrich公司。2種脂肪酸色酰胺的化學結構式見圖1。

圖1 二十二烷酸色酰胺和二十四烷酸色酰胺的
化學結構式
Fig.1 Chemical structures of the two fatty acid tryptamides

分別準確稱取0.010 0 g的BAT和LAT標準品于10 mL容量瓶中，用四氫呋喃(tetrahydrofuran, THF)溶解并定容至刻度線，搖勻，配制成1 mg/mL的單一標準儲備液。上述標準溶液置于冰箱中-18 ℃保存，根據使用需要，用流動相溶液逐級稀釋配制成適當濃度的混合標準工作液。

樣品：9批次不同來源可可粉樣品(F1～F9)和4批次可可殼樣品(K1～K4)，產地分別為印度尼西亞、厄瓜多爾、喀麥隆和加納，均由中國焙烤食品糖制品工業協會提供。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀(LC-10AT VP，配有熒光檢測器)，日本島津公司；高速多功能粉碎機(BJ-150型)，浙江德清拜杰電器有限公司；超純水發生器(Milli-Q Reference)，美國Millipore公司；超聲波清洗器(KQ-500DE)，昆山市超聲儀器有限公司；高速離心機，北京雷勃爾離心機公司，最大轉速10 000 r/min；Vortex Genius 3渦旋混勻器，艾卡(廣州)儀器設備有限公司；氮吹儀，北京帥恩科技有限責任公司；12通道固相萃取裝置，美國J.T.Baker公司；硅膠固相萃取柱和中性氧化鋁固相萃取柱(500 mg/6 mL)，上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品制備與前處理

將可可殼樣品用高速多功能粉碎機粉碎成粉末狀，貼明標簽，備用。

準確稱取1.00 g可可粉或可可殼粉樣品于50 mL具塞塑料離心管中，加入10 mL CHCl3，渦旋振蕩3 min，超聲提取10 min，9 000 r/min離心10 min，上清液用快速定性濾紙過濾于10 mL比色管中，氮吹干，用四氫呋喃溶解并定容至1.0 mL，待凈化。

用3 mL正己烷/乙酸乙酯溶液[V(正己烷)∶V(乙酸乙酯)=9∶1]活化硅膠柱，取0.2 mL樣液加于活化后的硅膠柱中，依次用5 mL正己烷/乙酸乙酯溶液[V(正己烷)∶V(乙酸乙酯)=9∶1]、3 mL正己烷/乙酸乙酯溶液[V(正己烷)∶V(乙酸乙酯)=8∶2]淋洗，最后用15 mL乙酸乙酯洗脫硅膠柱并收集洗脫液，將洗脫液于40 ℃水浴中氮吹干，然后用1 mL流動相溶解，過0.45 μm有機濾膜，待進樣分析。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：博納艾杰爾Venusil C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；柱溫：40 ℃；流速：1.0 mL/min；流動相：乙腈+四氫呋喃+水[V(乙腈)∶V(四氫呋喃)∶V(水)=90∶7∶3]；熒光檢測器：激發波長為281 nm，發射波長為330 nm；進樣量：10 μL。

2 結果與討論

2.1 提取方式的優化

為達到高效、短時的提取目的，采用渦旋振蕩配合超聲提取的方式，并考察超聲時間對提取的影響。實驗選取2個可可殼粉樣品，各取5組，先渦旋振蕩3 min，然后分別超聲提取5、10、15、20和30 min，然后對比提取效果(圖2)。

圖2 超聲時間對提取率的影響
Fig.2 Effect of different ultrasonic extraction duration
time on the target compounds

由圖2可見，超聲10 min以后樣品中BAT+LAT含量趨于穩定，說明再延長超聲時間對提取影響不明顯。因此，確定渦旋振蕩3 min結合超聲波提取15 min的方式作為樣品提取方法。

2.2 色譜條件的優化

根據脂肪酸色酰胺的性質，選用常用的十八烷基硅烷鍵合硅膠填料(C18)的反相色譜柱，比較了Venusil C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)和Innoval C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)的出峰和分離效果。實驗結果表明：兩款C18柱均能將BAT和LAT完全分離，Venusil C18色譜柱由于應用了鈍化的硅膠表面處理技術和先進的鍵合工藝，在用于各類非極性和中等極性化合物的分離時呈現出良好的色譜峰形，相對來說峰形尖銳而對稱，出峰較早，可在15 min內完成出峰，因此實驗選擇Venusil C18柱作為分析柱。

試驗考察了以甲醇、乙腈、四氫呋喃和水的不同配比為流動相進行分離，結果表明：乙腈、四氫呋喃和水的體積比為90+7+3，2種目標物質的分離度、峰形、響應值以及保留時間的穩定性均優于其他比例，基線穩定，分離度好，無其他成分干擾，見圖3。

圖3 兩種脂肪酸色酰胺標準品的HPLC標準色譜圖
Fig.3 Chromatogram of the BAT and LAT mixed
standard solution

2.3 凈化柱的選擇

固相萃取方法中常用的正相固相萃取柱為硅膠柱和氧化鋁柱。本研究考察了不同填料的固相萃取柱對脂肪酸色酰胺提取回收率的影響。通過實驗發現：使用硅膠柱和中性氧化鋁柱時，脂肪酸色酰胺的回收率均大于90 %；使用硅膠柱凈化樣品時，基線平穩且雜質少，目標物峰明顯(圖4)，符合定量分析要求。本研究最終選用硅膠填料固相萃取柱。

a-經中性氧化鋁固相萃取柱凈化；b-經硅膠固相萃取柱凈化圖4 可可粉和可可殼樣品中2種脂肪酸色酰胺HPLC譜圖Fig.4 Chromatograms of the BAT and LAT in cocoapowder and cocoa shell samples

2.4 線性參數及檢出限、定量限

分別移取1 mg/mL的單一標準儲備液，用流動相稀釋成50、100、200、500和1 000 μg/L的標準系列混合溶液，在1.3.2所述的色譜條件下，各進樣10 μL，繪制標準曲線。結果表明，在50～1 000 μg/L的濃度范圍內，分析物的質量濃度(X)和峰面積(Y)之間的線性關系良好，采用外標法對進樣的系列標準溶液進行線性回歸計算，得到線性方程和相關系數(r)。

表1 兩種脂肪酸色酰胺的線性方程、線性范圍和檢出限Table 1 Linearity parameters, limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) of two FATs

在可可粉樣品中添加低濃度的BAT和LAT混合標準儲備液，測定檢出限和定量限。結果表明：BAT和LAT的質量濃度和峰面積在50～1 000 μg/L線性范圍內線性關系良好，相關系數大于0.999 1，檢出限(LOD, S/N=3)和定量限(LOQ, S/N=10)分別為0.03 mg/kg和0.1 mg/kg(表1)。說明本方法適合實際樣品的測定。

2.5 方法的回收率和精密度

采用在已知樣品中添加標準溶液的方法，取可可粉樣品(F1)作為實驗樣品進行添加回收率實驗，考慮到可可粉樣品中的本底，BAT和LAT添加濃度設5、10和20 mg/kg 3個水平，分別進行3次平行實驗，由表2可知，2種目標物質的回收率在92%～103%之間，相對標準偏差(relative standard deviation, RSD)為2.1%～6.2%。由此可知本方法的回收率和精密度均符合分析要求。

表2 加標回收率實驗結果(n=3)Table 2 Recoveries and RSDs of two FATs bystandard addition method (n=3)

注：本底值、測定值和回收率為3次平行實驗的平均值。

2.6 實際樣品的測定

將可可粉樣品和可可殼樣品按1.3.1進行處理，按1.3.2色譜條件下進樣分析。采用外標法對實測樣品的2種脂肪酸色酰胺進行定性定量分析。樣品測定數據結果見表3。

表3 可可粉和可可殼樣品中2種脂肪酸色酰胺的含量(n=3)Table 3 The contents of two FATs in studied cocoapowder and cocoa shell samples (n=3)

注：FAT的值為BAT和LAT含量之和。

由表3可以看出，2種脂肪酸色酰胺類物質在4批可可殼中含量為208.9～228.8 mg/kg，在9批可可粉中含量為2.6～12.1 mg/kg，在可可殼中含量是其在可可粉中含量的17～88倍，平均含量為25倍。此外，由表3可以看出，除K2樣品值稍大外，LAT和BAT兩種物質在不同來源的可可粉和可可殼中的含量比值基本保持穩定狀態，即LAT的含量是BAT的2.1±0.4倍，說明在可可豆成熟后兩者的含量比值穩定。上述研究結果表明，這2種物質是穩定存在于可可中特有的脂肪酸色酰胺，且在殼中含量遠大于豆仁中含量，因此這2種物質可以作為特征指示物用來鑒別可可粉中是否含有可可殼粉，且可以通過測定樣品中這2種脂肪酸色酰胺的含量來推算可可粉中可可殼的含量比例。

2.7 鑒別模型的建立

為了鑒別可可粉中摻入可可殼粉的含量比例，本試驗模擬制備10個摻入不同比例質量分數可可殼粉的可可粉樣品(為了保險起見，特地選用FAT含量最高的粉樣品和FAT含量較低的殼樣品)，可可粉中分別摻入了5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%和90%的可可殼。利用上述前處理和色譜條件測定了這些樣品中BAT和LAT含量(表4)。

表4 模擬摻入可可殼粉的10個可可粉樣品中2種脂肪酸色酰胺含量Table 4 The contents of two FATs in 10 simulatedadulteration of cocoa powder samples

從感官上判斷，摻入了可可殼粉的可可粉，在顏色、氣味等物理性質方面與純的可可粉很難區分。但由表4中數據可以看出，隨可可殼粉添加量的增加，模擬樣品中2種目標物質的含量也是按一定比例增加的，因此可以建立一個FAT(BAT+LAT)含量與可可殼添加量之間簡單的線性關系定量鑒別模型：y=0.467 2x-7.503 6,r=0.999(x,FAT含量，mg/kg;y,可可殼摻入量,%)，通過本方法來計算樣品中檢測到的BAT和LAT的含量之和，就可以將摻入一定量可可殼粉的可可粉樣品從純可可粉樣品中區別出來。考慮到摻假比例的經濟性與可操作性，當摻入5%(質量分數)及以上可可殼時，應用本方法可予以較好鑒別。

2.8 盲樣驗證

為了驗證方法的可靠性與適用性，本試驗隨機選取4個可可粉樣品和4個可可殼樣品，兩兩一組按一定比例混合，模擬制成5個盲樣，然后從市場上購買4個商品可可粉樣品，其中M1～M5表示5個模擬盲樣，S1～S4表示市售可可粉樣品。按1.3.1和1.3.2條件測定這些樣品中FAT含量，并按2.7所建立定量鑒別模型計算可可殼摻入比例(表5)。

表5 盲樣和市售可可粉樣品中2種脂肪酸色酰胺含量及模型計算結果(n=2)Table 5 Predicted deviation of adulterant amount of cocoashell in cocoa powder and commercially available cocoapowder samples (n=2)

結果表明：模型預測的盲樣摻入可可殼粉的值與實際含量之間有較好的對應，預測結果的相對誤差在-10.4%～2.6%之間；模型預測的4個市售樣品的值均小于5%，說明這些樣品中無人為摻加可可殼的情況，均為正常工藝生產的可可粉。因此，從行業監管和實際生產應用角度來看，說明本定量鑒別模型完全可行。

3 結論

本文建立了固相萃取-高效液相色譜-熒光檢測器法檢測可可粉中二十二烷酸色酰胺和二十四烷酸色酰胺含量的方法，通過測定2種目標物質的含量，定量鑒別可可粉中可可殼的含量，從行業監管的角度，不僅可用于可可粉質量控制，還可用于鑒別出摻入可可殼5 %(占樣品質量的百分含量)及以上的摻假可可粉。本方法穩定可靠、重復性好、前處理簡單、靈敏度高，可以滿足大量樣品的日常監測，非常適合于可可制品生產企業對可可粉原料質量優劣的評價和摻假鑒別。