老年人阿爾茨海默病生物標志物研究進展

檀春玲 王 樺 張艷芳

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一種起病隱匿的進行性發展的神經系統退行性疾病，臨床表現為記憶、學習、定向、語言、理解和判斷等能力減退，是老年癡呆最為常見的類型，65歲以前發病者，稱早老性癡呆，65歲以后發病者稱老年性癡呆。AD發病率隨年齡增加而增加，隨著人口老齡化發展，全球神經退行性疾病人數增加，中國2010年癡呆癥總人數為9190萬，AD為5690萬，主要集中在60歲以上老年人［1］，預計中國老年期癡呆患病人數在未來仍繼續增長，2030年老年期癡呆患病人數為2010年的2.8倍，85歲以上老年人癡呆的患病人數將達607萬［2］。AD患者隨病情進展，癥狀逐漸加重，最終失去生活能力，給家庭、社會帶來沉重的負擔。然而，目前尚不能對阿爾茨海默病進行有效的對因或對癥治療。因此，在社會老齡化發展的背景下，早期診斷及預防AD具有重要意義。

雖然病理診斷為AD的金標準，但隨著生物技術的不斷發展，診斷標準已發展為臨床癥狀、影像學、生物標志物等綜合診斷。目前認為，AD患者從開始有病理改變到出現臨床癥狀是一個連續變化的過程，病理生理改變在臨床癥狀出現的前15～20年就已經開始。2011年美國國家老化研究所和AD協會推薦了新的AD診斷標準，將AD分為臨床前階段、輕度認知障礙階段（mild cognitive impairment，MCI）和癡呆階段。臨床前階段是指沒有臨床表現或臨床癥狀極其輕微但已出現神經病理改變，MCI是指記憶力或其他認知功能進行性減退，不影響日常生活能力，且未達到癡呆的診斷標準。多年來，研究者為了更好地揭示神經變性的機制以及幫助AD的早期診斷，已經進行了大量的探索和試驗，尋找可靠的生物標志物可以幫助AD的臨床前診斷，為早期預防和治療提供重要依據。目前對于AD早期診斷的生物標志物研究主要集中在AD的病理改變，包括腦β-淀粉樣蛋白（amyloidβ，Aβ）沉積和神經原纖維纏結，涉及腦脊液、血液、唾液等生物標本檢測及眼底、神經系統影像學等輔助檢查。本文將AD近年的生物標志物研究概況做如下筆談。

1 腦脊液中的生物標志物

腦脊液（cerebrospinal fluid，CSF）和腦組織直接接觸，可相對敏感的地反映腦組織的病理改變。目前已經廣泛研究的腦脊液標志物為Aβ和tau蛋白，Aβ由β淀粉樣前體蛋白經酶水解成多肽，最多見的亞型為Aβ42與Aβ40，Aβ42有較強的神經毒性，在神經細胞外異常沉積形成Aβ斑塊，是AD的典型病理表現。tau蛋白為構成神經細胞骨架微管的相關蛋白，其過度磷酸化與神經原纖維纏結、神經退行性改變密切相關，主要通過檢測CSF中總tau（T-tau）和磷酸化tau（P-tau）來反映病變。目前，CSF中Aβ42降低、T-tau和P-tau升高被認為是AD患者癡呆期的特征性表現。研究表明，與認知正常人相比，AD中 CSF Aβ42水平平均下降50%，T-tau增加300%，P-tau增加200%［3］，這組生物標志物被認為是AD病理學的核心標志物，并被納入AD的修訂診斷標準。2014年國際工作組（International Working Group，IWG）發表了IWG-2標準，將腦脊液Aβ和tau、淀粉樣蛋白正電子發射型計算機斷層顯像（positron emission tomography，PET）和AD致病基因攜帶作為AD的診斷標志物。

生物標志物有效性的個體研究差異很大，全面的薈萃分析的結果證實了三種核心標志物均具有80%～90%的敏感性和特異性［4］，聯合應用標志物比單獨使用準確性更高。Lewczuk等［5］以 Aβ42／Aβ40比值診斷AD的敏感性與特異性分別為93.3%和100%。CSF中Aβ42聯合tau蛋白比單獨應用兩者診斷AD有更高的敏感性和特異性。Forlenza等［6］對比研究了CSF中Aβ42和tau蛋白的不同的水平及組合的敏感性與特異性，發現結合 Aβ42＜416.5 pg／mL和 Aβ42／P-tau＜9.5能最有效預測2年內發展為AD的風險。此外，CSF中Aβ42、T-tau和P-tau含量不僅可作為AD癡呆期的診斷標志物，還可用于幫助評估MCI向AD的轉歸。Rizzi等［7］發現 CSF中單獨的Aβ42比單獨的P-tau或其與Aβ42的聯合作為MCI進展至AD的預測因子效果更顯著，說明淀粉樣蛋白病理改變早于tau的病理變化，CSF Aβ42在患者認知正常的早期階段出現異常，而tau在疾病進一步發展的后期階段增加。

CSF潛在的生物標志物也在不斷發現和探索中，近年還研究的一些CSF標志物如：（1）突觸丟失，是阿爾茨海默病在神經元死亡和癥狀發作之前的病理改變，在一項交叉隊列薈萃分析中，與正常對照區相比，6種突觸蛋白（Calsyntenin-1，GluR4，Neurexin-2A，Neurexin-3A，Syntaxin-1B，Thy-1）在臨床前 AD降低，提示這些蛋白質可能具有評估疾病進展的臨床價值［8］；（2）神 經 絲 輕 鏈 蛋 白 （neurofilament protein，NFL），是構成神經細胞軸突中間絲的蛋白質，可反映AD患者神經元的軸突破壞，腦脊液NFL濃度在AD的早期臨床階段增加，AD和MCI患者CSF中NFL濃度顯著升高，且 AD中更高；（3）幾丁質酶-3樣蛋白-1（chitinase-3-like protein-1，CHI3L1 or YKL-40），是活化的小膠質細胞和星形膠質細胞的標志物，研究發現AD和MCI患者CSF中YKL-40濃度升高，提示YKL-40可作為區分AD或MCI與正常對照組的特異性標志物；（4）人視錐樣蛋白1（visinin-like protein-1，VILIP-1），是神經元胞質中的鈣傳感蛋白，研究發現VILIP-1水平的下降可以預測全腦、海馬區和內嗅區的萎縮率，可為早期癥狀和臨床前AD中的神經變性提供有用的CSF生物標志物替代物；（5）β位點的APP裂解酶1（β-site amyloid precursor proteincleaving enzyme 1，BACE1），是 Aβ生成的限速酶，MCI患者與AD患者或對照組相比 BACE1水平更高；（6）心臟脂肪酸結合蛋白（heart-type fatty acid-binding protein，HFABP），是心臟中富含的一種新型小胞質蛋白，在心臟以外的組織中也有低濃度表達，因為與CSF Aβ42水平有關被認為是潛在的AD生物標志物之一；（7）神經元特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE），在腦組織細胞的活性較高，研究發現表明AD患者CSF中NSE明顯高于正常對照組，具有作為癡呆癥特異性標記物的潛力［9］。其他腦脊液標志物還有神經生長因子、神經元正五聚蛋白Ⅱ、微小RNA、F2-異前列腺素等。一項對AD的15種生物標志物的meta分析結果顯示，除了三種核心標志物，CSF中 NFL與AD密切相關，新出現的生物標志物NSE、VILIP-1、HFABP和 YKL-40與 AD中度相關［10］。

CSF檢查費用并不昂貴，被視為可行的診斷AD生物標志物來源，除了核心標志物被逐漸認可外，新的標志物敏感性與特異性仍有待研究。然而，腦脊液穿刺取樣為有創檢查，重復取樣受限，我國老年人對其普遍接受程度不高，因此目前多用于臨床研究。由于尚缺乏大量科學證據支持CSF生物標志物在前驅AD的鑒別診斷中的應用，因此CSF中生物標志物作為AD的臨床前階段的輔助診斷暫未廣泛應用。

2 外周血中的生物標志物

血液易于獲得與檢測，是AD臨床診斷標志物的理想標本，CSF Aβ42被廣泛接受為AD的核心生物標志物，因而血漿Aβ42也引起了研究者的廣泛關注。使用超靈敏免疫分析技術發現，Aβ42水平和血漿中Aβ42／Aβ40的比例與 CSF中和PET測量的腦 Aβ沉積結果相一致，且血漿Aβ42／Aβ40比例與認知下降的個體進展為MCI或癡呆的風險相關。Ovod等［11］使用質譜法發現在PET提示Aβ陽性的個體具有較低水平的血漿 Aβ42和 Aβ42／Aβ40。除了使用新技術之外，還可以對血漿樣品進行化學處理以減少Aβ的降解并提高血漿Aβ測量的準確度。全自動血漿免疫測定顯示Aβ42／Aβ40可明顯區別MCI和AD患者。然而，也有研究顯示血漿Aβ42、Aβ40與AD無明顯相關性［10］。總體來說，血漿中Aβ作為標志物的穩定性仍有爭議。

除了CSF中tau生物標志物，血漿tau蛋白也顯示出臨床診斷AD潛力。Tau蛋白可以發生裂解進而釋放入外周血中，通過蛋白質組織化學技術手段可以推測出外周血液中tau蛋白的濃度。薈萃分析［10］顯示血漿T-tau蛋白和AD之間存在關聯。縱向研究發現，較高水平的血漿T-tau蛋白與認知能力下降和MCI風險增加有關［12］，但也有研究發現 MCI受試者和正常對照組之間血漿T-tau未見明顯差異［13］。此外，在CSF中可以檢測到多種其他tau蛋白肽片段，有些可能具有作為AD生物標志物的潛力。研究發現［14］，與對照組相比，AD患者中有多種不同的磷酸化tau蛋白上調，而非磷酸化tau蛋白也具有作為診斷生物標志物的潛力。這些初步研究可能會引申對新型tau蛋白生物標志物的進一步研究，并對tau蛋白定向療法的開發尤有助益。

除了與AD密切相關的Aβ、tau蛋白之外，其他血漿候選的生物標志物仍在不斷被發現，主要包括各種炎癥因子、血漿脂蛋白、血脂、血尿酸等。在對40項血液標志物研究和14項CSF標志物研究的薈萃分析［15］中，AD患者相對于對照組，外周血中 IL-6、IL-12、IL-18、腫瘤壞死因子（TNF）-α、IL-1β和轉化生長因子（TGF）-β水平較高。在另一項對175項血液標志物研究的薈萃分析［16］中，AD患者相對于對照組，血 IL-1β、IL-2、IL-6、IL-18、干擾素 -γ、同型半胱氨酸、高敏C反應蛋白、CXC基序趨化因子-10、表皮生長因子、血管細胞粘附分子-1、TNF-α轉換酶升高，而TNF受體1和2、α1-抗胰凝乳蛋白酶、IL-1受體拮抗劑和瘦素偏低。Rui等［17］發現與健康對照組相比，AD和VaD患者的血漿胱抑素C（cystatinC，Cys C）水平較高，但 HDL水平較低，血漿 Cys C和HDL水平可能是AD或VaD患者的有用篩查標志物。薈萃分析發現血清尿酸水平與阿爾茨海默病之間存在負相關，高血清尿酸水平是阿爾茨海默病的保護因素［18］。這些新發現的血漿標志物尚待更多研究去檢驗其特異性和敏感性。

3 唾液中的生物標志物

唾液測試是非侵入性的，標本簡便易取。最近的研究證明檢測唾液β淀粉樣蛋白水平可區分AD患者與正常對照組。Bermejo-Pareja等［19］分析了來自AD患者和年齡性別匹配的對照組共126份唾液樣本，發現輕度至中度AD患者的Aβ42水平顯著升高，提示唾液Aβ42水平可作為AD的潛在外周標志物。Sabbagh等［20］證明發現AD患者分泌的Aβ42水平均超過對照組的兩倍，提示唾液Aβ42水平可用于診斷AD以及預測其未來發病的風險，而且可作為早期階段診斷AD的輔助手段。

4 尿液中的生物標志物

AD相關神經元線蛋白（Alzheimer-associated neuronal thread protein，AD7c-NTP）是存在于神經元軸突的一種腦蛋白，組織學顯示大多數AD患者與對照組在額葉和顳葉組織中AD7c-NTP蛋白的量存在顯著差異。研究發現AD患者尿AD7c-NTP明顯高于非AD組，且薈萃分析提示尿AD7c-NTP是診斷可能AD的敏感和特異性檢測方法［21］。此外，MCI患者的尿AD7c-NTP水平高于健康人，并且介于AD患者于正常對照區之間，這表明尿AD7c-NTP水平可能是早期診斷MCI的重要生物標志物［22］。Yoshid等發現尿液中3-羥丙基巰基尿酸（3-hydroxypropyl mercapturic acid，3-HPMA）與肌酐（creatinine，Cre）的比值可協助診斷AD，尿液中3-HPMA／Cre的減少與AD患者血漿中Aβ40／Aβ42的增加密切相關，AD患者3-HPMA／Cre明顯低于健康對照組，而MCI患者3-HPMA／Cre介于兩組之間［23］。尿液檢測也有望尋找潛在的生物標志物。

5 眼部的生物標志物

光學相干斷層掃描技術（Optical Coherence tomography，OCT）是近十年迅速發展起來的一種成像技術。最近的研究發現，視網膜結構可能作為癡呆癥的生物標志物。癡呆中的神經變性主要通過腦萎縮來評估，而視網膜神經變性可使用OCT檢測，主要為視網膜神經纖維層（retinal nerve fibre layer，RNFL）和神經節細胞-內叢狀層（ganglion cell-inner plexiform layer，GC-IPL）的厚度。荷蘭一項五千多人的研究發現［24］，RNFL與癡呆風險增加有關，包括阿爾茨海默病，提示視網膜神經變性可能成為癡呆的臨床前生物標志物。不僅MCI患者和對照組之間存在顯著差異，而且MCI患者和其他兩組AD組（中度和重度AD）的RNFL厚度也存在顯著差異［25］。最近對11項 AD患者的OCT研究的薈萃分析發現，AD患者平均RNFL和黃斑周圍的所有4個視網膜象限均顯著減少［26］，在其中三項含有MCI患者的研究中，與對照組相比，發現RNFL厚度減少。Ong等［27］人報道了在老年人群（＞60歲）中使用OCT和MRI掃描，他們發現GCIPL厚度變薄反映的視網膜神經元損傷與枕葉和顳葉中的灰質損失獨立相關，這表明視網膜中的神經元損傷可能與AD患者神經變性是同步的。

與大腦相似，視網膜具有高度隔離和保護的脈管系統。由于AD患者腦中存在血管變化，因此可能在AD視網膜中發現類似的變化。在一項研究中Berisha等［28］發現AD患者視網膜靜脈直徑減小而血流量下降。Cheung等［29］發現AD患者的視網膜小靜脈結構較復雜，直徑較小，較稀疏、曲折，重要的是，MCI患者的血流介于AD患者和對照組之間，這表明視網膜血流量可用于監測疾病進展。視網膜血氧測定用于檢測眼代謝的變化，在AD也有異常的變化，研究發現AD患者的小動脈和小靜脈視網膜氧飽和度較正常者高［30］。可見，眼部的標志物主要集中在視網膜及血管的變化。

綜上所述，AD的生物標志物是目前AD研究的熱點，生物標志物在AD，特別是早期的診斷中具有一定臨床意義。目前CSF Aβ和tau蛋白、淀粉樣蛋白正電子發射型計算機斷層顯像和AD致病基因攜帶被列入為AD的診斷標志物中。有效的生物標志物需要良好的敏感性特異性，能夠幫助臨床診斷，指導治療，或判斷疾病的發展及預后。同時，用于檢測標志物的標本以無創、經濟、簡便易取、重復取用為宜，除了已經廣泛研究的核心標志物，血液、尿液、唾液、視網膜等潛在標志物正不斷的開發，有望提高患者早期診斷的準確性。