石斛合劑對糖尿病模型大鼠內脂素及血糖的影響

王 林，施 紅，張捷平，鄭雪花，王曉寧

（福建中醫藥大學中西醫結合學院，福建 福州 350122）

研究發現2型糖尿病患者表現為慢性低度炎癥反應，而慢性炎癥的發生與糖尿病過程中多種炎癥因子，尤其是脂肪細胞因子表達分泌紊亂有密切關系。脂肪細胞因子不僅在脂肪組織表達分泌，在其他靶器官如肝臟、腎臟中也有表達，在正常情況下參與血糖、血脂水平的調節和代謝，其表達分泌異常在糖尿病的發生及病情的進展發揮重要作用［1-2］。脂肪細胞因子內脂素（visfatin）是糖尿病發病與病情進展的重要相關細胞因子［3］。目前研究認為其是糖尿病發生的獨立相關因素，也在糖尿病并發癥包括肝臟損害、糖尿病腎病的發生與進展中扮演了重要作用。我們采用石斛合劑治療2型糖尿病患者，發現其有降低血糖、調整血脂、改善胰島素抵抗、促胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）分泌、促胰島β細胞增殖的作用［4-6］，對糖尿病慢性炎癥反應有改善作用，對糖尿病時靶器官有保護作用［7-9］。本研究通過觀察石斛合劑對糖尿病模型大鼠visfatin表達的影響，分析其對糖尿病時慢性炎癥狀態改善作用及對靶器官保護作用的機理。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF級SD雄性大鼠30只，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，實驗動物許可證號：SCXK（滬）2007-0005，合格證號：0073141，飼養于福建中醫藥大學實驗動物研究中心。

1.2 實驗藥物和試劑 石斛合劑（組方包含石斛、生地黃、黃芪、丹參）由福建中醫藥大學國醫堂提供；鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma公司）；微量血糖檢測儀及血糖檢測試紙（上海復旦大學張江生物醫藥股份有限公司）；Trizol試劑、M-MLV Reverse Transcriptase逆轉錄試劑盒（美國Invitrogen公司）；Perfect Real Time-SYBR Premix EX Taq Kit實時定量PCR試劑盒（大連寶生物有限公司）；visfatin ELISA檢測試劑盒、抗體（英國Abcam公司）；免疫印跡RIPA裂解液（上海碧云天生物技術有限公司）；甘油三酯（TC）、總膽固醇（TG）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20170430、20170515）。

1.3 實驗設備 Stratos高速冷凍離心機（賽默飛世爾科技中國公司）；DU730分光光度計（美國Beckman Coulter公司）；Gel Doc XR凝膠電泳成像檢測分析系統（美國Bio-Rad公司）；DYY-6C雙穩定時電泳儀（北京市六一儀器廠）；ULT-1386-5V超低溫冰箱（賽默飛世爾科技中國公司）；Epgradient S實時熒光定量PCR儀（德國Eppendorf基因有限公司）；BIO-RAD蛋白電泳儀器［伯樂生命醫學產品（上海）有限公司］；快速血糖檢測儀（德國 Roche公司）；Beckman X20自動生化分析儀（美國Beckman Coulter公司）。

2 實驗方法

2.1 石斛合劑藥液制備 石斛、黃芪、丹參、生地黃等中藥水煎。購買藥材加入1000 mL蒸餾水中，浸泡30 min，大火煮沸10 min后，小火煎煮20 min，濾出藥液。水煎2次，所得藥液混合后濃縮，濃縮至1.2 g／mL生藥量濃度。

2.2 動物造模 SPF級健康成年雄性SD大鼠30只，體質量（200±20）g，適應性喂養 1 周，自由攝食攝水，采用簡單隨機抽樣抽簽法，選取6只為正常組，余24只為造模組。正常組進食普通混合飼料，造模組進食高脂高糖飼料（配方為普通混合飼料88.5%、豬油10%、膽固醇 1%、膽酸鈉0.5%）。飼養4周后造模組禁食12 h，鼠尾采血檢測血糖后，予鏈脲佐菌素腹腔注射，用量為30 mg／kg體重，注射后喂食普通混合飼料。注射后第3天，禁食12 h，鼠尾采血測血糖，空腹血糖水平≥11.1 mmol／L為糖尿病模型大鼠。其中1只死亡，4只未成模，成模19只。

2.3 動物分組及給藥 選取12只造模組大鼠隨機分為模型組和石斛合劑組各6只，石斛合劑組予石斛合劑藥液按 12 g／（kg·d）進行灌胃，模型組和正常組予等量生理鹽水灌胃，共灌胃干預8周。

2.4 取材 末次給藥后次日禁食，鼠尾取血，血糖檢測儀快速檢測血糖。30%烏拉坦腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，離心后分離血清，4℃備用。檢測血生化指標及血清visfatin水平。取大鼠內臟脂肪組織、肝臟、腎臟液氮保存備用。

2.5 觀察指標及方法

2.5.1 血清學指標檢測 檢測3組大鼠空腹血糖及血清中TG、TC含量，并采用ELISA法檢測血清中visfatin水平。

2.5.2 組織visfatin mRNA表達水平檢測 取大鼠內臟脂肪、肝臟、腎臟組織樣本各30 mg，以液氮碾磨后采用Trizol試劑提取各組織總RNA。檢測各樣本提取RNA的OD260／OD280比值，分析計算總RNA純度和濃度。每樣品取5 μg總RNA，使用qRTPCR試劑盒采用 Oligo（dT）20引物進行逆轉錄，合成cDNA。應用Prime5.0軟件設計引物，visfatin：正向引物5'-TCTGGAAATCCGCTCGACAC-3'，反向引物5'-AGTAAGTTCCCCTGCCTCAC-3'，擴增片段長度129 bp。 β-actin：正向引物 5'-ATTGTGATGGACTCCGGAGA-3'，反向引物5'-CTCGTCAGGATCTTCATGA-3'，擴增片段長度136 bp。反應體系：2×SYBR 12.5 μL，10 μmol／L 正向、反向引物各 0.5 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O補至體積 25 μL。 反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s；55～60 ℃ 20 s；72 ℃ 30 s；共45個循環。融解曲線分析：溫度60～95℃，每個樣本重復實驗檢測3次。以β-actin作為內參，以相對表達量2-△△Ct來表示目的基因mRNA的相對表達水平。

2.5.3 組織visfatin蛋白表達水平檢測 取大鼠內臟脂肪、肝臟、腎臟各樣本組織30 mg，加入液氮碾磨，采用RIPA裂解液裂解后提取蛋白，BCA法檢測各樣品上清液蛋白濃度。取50 μg蛋白，經10%SDS-PAGE凝膠電泳，電轉印至硝酸纖維素膜，室溫以5%脫脂牛奶封閉。加入一抗（1∶1 000）4℃孵育過夜，以TBST洗膜，加入堿性磷酸酶標記的二抗（1∶2 000）室溫孵育 2 h，充分洗滌后顯影。 以βactin作為內參，采用美國Flour ChemV 2.0凝膠成像分析軟件，掃描蛋白電泳條帶的灰度值，進行定量分析，結果以目的蛋白灰度／內參β-actin灰度比值表示。

2.6 統計學方法 采用SPSS 20.0統計學軟件進行數據分析。計量資料采用（）表示，組間比較采用One-Way ANOAY方差分析。相關性分析采用Pearson簡單相關分析。

3 結 果

3.1 3組大鼠空腹血糖、血脂及血清visfatin水平比較 見表1。血清visfatin水平與血糖水平相關性分析，結果見圖1。Pearson相關分析顯示r＝0.767，P＝0.002，血糖水平與血清visfatin水平呈正相關。

表1 3組大鼠空腹血糖、血脂及血清visfatin水平比較（）

表1 3組大鼠空腹血糖、血脂及血清visfatin水平比較（）

注：與正常組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.01。

組別正常組模型組石斛合劑組鼠數666空腹血糖 ／（mmol／L）5.06±0.85 30.31±3.561）18.41±5.531）2）TG／（mmol／L）0.85±0.09 1.92±0.211）1.46±0.151）2）TC／（mmol／L）1.13±0.16 2.23±0.311）1.61±0.201）2）血清 visfatin／（pg／mL）137.17±10.94 210.67±22.321）168.52±15.631）2）

圖1 血清visfatin水平與血糖水平關系散點圖

3.2 3組大鼠不同組織visfatin mRNA表達水平比較 見表2。

3.3 3組大鼠不同組織visfatin蛋白表達水平比較見圖 2、表 3。

表2 3組大鼠不同組織visfatin mRNA表達水平比較（）

表2 3組大鼠不同組織visfatin mRNA表達水平比較（）

注：與正常組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.01。

組別正常組模型組石斛合劑組n666內臟脂肪1.02±0.09 4.40±0.511）2.41±0.791）2）肝臟1.02±0.14 2.53±0.551）1.57±0.281）2）腎臟0.96±0.10 2.04±0.521）1.59±0.191）2）

圖2 3組大鼠不同組織visfatin蛋白表達電泳圖

表3 3組大鼠不同組織visfatin蛋白表達水平比較（）

表3 3組大鼠不同組織visfatin蛋白表達水平比較（）

注：與正常組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.01。

組別正常組模型組石斛合劑組n666內臟脂肪0.38±0.11 0.85±0.111）0.53±0.141）2）肝臟0.43±0.09 0.64±0.121）0.45±0.091）2）腎臟0.51±0.80 0.74±0.141）0.52±0.171）2）

4 討 論

傳統醫學認為糖尿病早期發病機理是陰虛燥熱。陰津虧耗致燥熱偏盛，燥熱盛則陰津虛，兩者互為因果。如不及時恰當治療，病程遷延陰損耗氣，而致氣陰兩虛。臟腑功能失調，津液代謝障礙，氣血運行受阻，痰濁瘀血內生，全身脈絡瘀阻，臟腑器官失去氣血滋養引起多器官病變。若病程遷延日久或因治療失當，陰損及陽，終致陰陽俱虛。石斛合劑滋陰清熱、益氣活血，兼以疏肝解郁、清肝泄濁，能解除病況中的陰虛、氣虛、血瘀狀況，改善臟腑狀態。前期的研究證實其能顯著調整血糖、血脂水平［4-6］。

visfatin是一種與血糖調節有關的重要細胞因子，在人和動物的脂肪細胞、肝細胞、骨骼肌、腎臟等均有表達，其可通過提高脂肪和肌肉組織葡萄糖攝取能力，降低肝糖原的釋放來影響血糖水平，調節糖代謝。還能直接與胰島素受體結合，激活胰島素調節脂肪細胞糖代謝的相關信號通路，有類胰島素樣作用［10］。近年來不少研究證實，visfatin與糖尿病之間有著密切的關系。Alghasham等［11］研究發現，無并發癥的糖尿病患者血visfatin含量明顯高于非糖尿病組和有并發癥的患者。Chen等［12］用酶免法測量了61名糖尿病患者和 59名健康對照者血漿visfatin含量，結果發現：與正常人對比，糖尿病患者血漿visfatin含量顯著升高，且與體脂含量成正相關，提示visfatin的表達與血糖水平改變及機體脂肪代謝有關，這可能是調節機體糖代謝穩態的重要機制之一，在糖尿病的發生發展過程中起重要作用。

本實驗以糖尿病模型大鼠為研究對象，觀察石斛合劑灌胃后大鼠內臟脂肪、肝臟、腎臟中visfatin的水平變化。檢測到石斛合劑組與模型組比較，組織中visfatin表達量顯著下降，且與血糖變化水平呈現正相關，說明石斛合劑可以改善多組織中的visfatin的表達，達到降糖效果，其作用具有多環節、多靶器官特點。另外目前研究認為2型糖尿病是由炎癥因子介導的慢性炎癥反應性疾病，visfatin也是重要的促炎癥因子，其在糖尿病慢性炎癥發展過程中也起重要作用［13］。石斛合劑降低組織中visfatin的表達可改善組織器官慢性炎癥狀態，提示了石斛合劑對糖尿病慢性器官病變的作用，而慢性炎癥狀態與血糖水平的變化將是接下來研究的內容。本研究為石斛合劑降糖作用及其對靶器官的保護作用提供了理論支持。