HPLC法同時測定白芍中5種成分含量

張嘉嘉，馬 遲，朱志靈，張松柏，張 勛

（福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122）

白芍為毛莨科植物芍藥（Paeonia lactiflora Pall.）的干燥根，具有養血調經、斂陰止汗、柔肝止痛、平抑肝陽的功效［1］，主要分布于安徽、浙江、四川等地［2］。其主要有效成分為芍藥苷、芍藥內酯苷以及沒食子酸等［3］，具有保肝、抗炎、抗風濕、免疫調節功能等藥理作用［4］。芍藥苷和芍藥內酯苷是白芍眾多成分中公認的藥效物質，以前者含量最高；芍藥內酯苷為芍藥苷的同分異構體，在補血、抗抑郁、糖尿病潛在治療方面具有優于芍藥苷的藥效特點［5］；沒食子酸具有抗炎的作用［6］。2015版《中華人民共和國藥典》僅以芍藥苷作為含量測定的指標性成分，成分單一，專屬性不強，不足以反映白芍的總體質量。錢珺等［7］采用HPLC法同時測定白芍顆粒中的5種成分，以乙腈與0.1%磷酸為流動相，但考慮到該流動相體系對色譜柱和儀器損傷較大，希望可以探索出更好的流動相體系。因此本文收集了20批白芍飲片及藥材，采用HPLC法對其所含的沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、β-五沒食子酰葡萄糖5種成分進行測定，以期為提高白芍質量控制提供科學依據。

1 實驗材料

1.1 實驗儀器 AR224CN型電子分析天平（常州奧豪斯儀器有限公司）；EX225DZH型電子天平（奧豪斯儀器有限公司）；KQ-500DE型醫院數控超聲清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）；安捷倫1260高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）。

1.2 實驗材料 白芍對照藥材（中國食品藥品質量檢定研究院，批號：120905-201109）；沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷（上海源葉生物科技有限公司，批號：B20851、YY90574、YY90477、B21148）；β-五沒食子酰葡萄糖（上海麥克林生化科技有限公司，批號：P816672）；甲醇、甲酸、乙腈均為色譜純（默克化工技術有限公司）；實驗用水皆為實驗室蒸餾水。20批白芍樣品信息見表 1（其中1～19號均經過福建中醫藥大學藥學院黃澤豪老師鑒定，均為白芍飲片；20號為白芍對照藥材）。

表1 20批白芍樣品信息

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適應性 Welch Ultimate?XB-C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相乙腈（A）-0.05%甲酸（B）。 梯度洗脫：0～10 min，5%～10%A；10～30 min，10%～15%A；30～45 min，15%～30%A。 流速1 mL／min；檢測波長 230 nm；柱溫 30℃；進樣量5 μL。各峰的分離度均大于1.5。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、β-五沒食子酰葡萄糖適量，加甲醇超聲溶解后分別制成346.8、319.6、222.0、366.8、353.6 μg／mL 的對照品儲備液。 分別精密吸取對照品儲備液適量，用甲醇稀釋得每1 mL含 86.7、79.9、55.5、91.7 和 88.4 μg 上述 5 種成分的混合對照品溶液，保存于4℃冰箱中備用。

2.3 供試品溶液的制備 取本品粉末過80目篩，精密稱取0.25 g，置25 mL具塞三角燒瓶中，精密加入75%甲醇后超聲處理（功率240 W，溫度60℃）30 min，放冷，補足失重。過0.45 μm濾膜，取續濾液，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 標準曲線 精密吸取“2.2”項下的混合對照品儲備液于20 mL量瓶中，依次對半稀釋得5組不同濃度的對照品混合液，編號 1～6。按“2.1”項測定。以對照品的濃度（μg／mL）為橫坐標（X），峰面積（mAU）為縱坐標（Y），繪制標準曲線，得到回歸方程和相關系數，結果見表2。

表2 5種成分的線性回歸方程

2.4.2 精密度 取對照品稀釋混合液 5 μL，按“2.1”項進行測定。一天內連續進樣6次，記錄峰面積。結果沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、β-五沒食子酰葡萄糖峰面積的RSD分別為0.36%、1.73%、0.39%、3.0%、1.59%，5種成分峰面積的RSD均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩定性 取1份批號為Bs2015121506的樣品制備供試品溶液，分別于第0、12、24、36和48 h按“2.1”項進行測定。結果沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、β-五沒食子酰葡萄糖峰面積的RSD 分別為 2.98%、2.68%、2.37%、1.73%、2.41%，表明白芍供試品溶液中各成分在48 h內穩定性良好。

2.4.4 重復性 取批號為Bs2015121506的樣品6份，按“2.3”項制備供試品溶液，按“2.1”項測定。 結果沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、β-五沒食子酰葡萄糖峰面積的RSD分別為2.76%、2.78%、2.05%、1.37%、1.93%，5種成分峰面積的RSD均小于3%，表明本方法重復性良好。

2.4.5 加樣回收率 取批號為Bs2015121506的樣品、精密稱取6份，分別加入樣品含量50%的對照品溶液，按“2.3”項方法制備供試品溶液，“2.1”項測定，記錄峰面積，計算平均加樣回收率。結果沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、β-五沒食子酰葡萄糖的平均加樣回收率分別為100.37%、99.03%、101.22%、100.94%、101.79%，RSD 分 別為2.34%、2.53%、2.78%、1.21%、2.65%。

2.5 樣品測定 2.3項下處理20批樣品，“2.1”項下進行測定，采用外標法計算沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、β-五沒食子酰葡萄糖的含量，結果見表3。

3 討 論

3.1 檢測波長的選擇 混合對照品稀釋液在190～400 nm的波長范圍內檢測，分別在250 nm和230 nm附近出現兩個吸收峰，且在230 nm下各目標成分峰形、分離度較好，檢出強度適中，故選擇230 nm為檢測波長。

3.2 流動相的選擇 15版藥典以乙腈與0.1%磷酸為流動相，但對色譜柱和儀器損傷較大，本實驗考察不同濃度的甲酸對芍藥苷拖尾因子的影響，可以改善芍藥苷峰形。

3.3 提取溶劑的選擇 考察不同濃度的甲醇、乙醇對目標成分提取效率的影響，結果選擇75%甲醇作為提取溶劑時提取效率最高。

3.4 提取方法的選擇 在提取方法的選擇上采用高效液相色譜為檢測手段，以提取效率為考察參數，將回流提取法和超聲提取法進行比較。結果顯示，在提取時間、提取試劑用量等方面，超聲提取更有優勢，提取時間短、提取效率高，是中藥材有效成分提取的一種新興方法。

綜上所述，本研究建立HPLC法，同時測定白芍中沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、β-五沒食子酰葡萄糖5種成分的含量，可以為白芍整體質量控制評價體系的建立提供實驗依據。

表3 20批白芍樣品5種成分含量%

序號1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20樣品批號Bs2015121401 Bs2015121402 Bs2015121403 Bs2015121404 Bs2015121405 Bs2015121406 Bs2015121407 Bs2015121408 Bs2015121409 Bs2015121410 Bs2015121501 Bs2015121502 Bs2015121503 Bs2015121504 Bs2015121505 Bs2015121506 Bs2015121507 Bs2015121508 Bs2015121509 Bs2015121510沒食子酸含量0.084 0.102 0.117 0.097 0.087 0.152 0.080 0.156 0.090 0.083 0.101 0.096 0.084 0.098 0.096 0.093 0.125 0.129 0.111 0.137氧化芍藥苷含量0.016 0.022 0.000 0.025 0.016 0.000 0.010 0.000 0.025 0.023 0.020 0.022 0.016 0.019 0.027 0.026 0.017 0.018 0.021 0.023芍藥內酯苷含量0.454 0.534 0.462 0.566 0.726 0.943 0.753 0.947 0.517 0.449 0.539 0.526 0.454 0.406 0.563 0.940 0.454 0.454 0.446 0.537芍藥苷含量0.260 2.380 0.260 2.470 1.430 0.090 2.290 0.190 2.240 2.430 2.090 2.170 2.120 2.870 2.870 2.830 2.590 2.620 2.770 2.880 β-五沒食子酰葡糖含量0.223 0.286 0.306 0.319 0.238 0.381 0.292 0.330 0.240 0.292 0.239 0.276 0.223 0.201 0.250 0.308 0.316 0.422 0.253 0.409