生殖器皰疹患者NK細胞、sHLA-G、IFN-γ和炎癥因子水平觀察及其臨床意義研究

曹獻芹 郭珊 李冰

近年來，生殖器皰疹的發生率明顯上升，流行病學研究提示，生殖器皰疹的發病率平均維持在636～584/萬人[1]。臨床上生殖器皰疹的發生能夠導致生殖道黏膜上皮及肛周組織的損傷，嚴重影響患者的生活質量[2]。

在探討生殖器皰疹感染機制的過程中發現，免疫功能紊亂或炎癥損傷，均可能提高生殖器皰疹的發生風險，導致生殖道黏膜組織損害程度的增加[3]。自然殺傷（NK）細胞數量的上調，能夠維持患者體內淋巴細胞的免疫活性，提高其對病原體的吞噬和清除作用；γ 干擾素（IFN-γ）是調控自身淋巴細胞免疫狀態的指標，IFN-γ 的上升能夠提高患者體內T淋巴細胞的活性，促進樹突狀細胞的抗原提呈功能的上升[4]；可溶性人類白細胞抗原G（sHLA-G）是重要的趨化因子，sHLA-G 的上升能夠通過激活體內的趨化因子，促進炎癥細胞對生殖道黏膜的浸潤，進而促進病情的進展[5]。為了揭示NK 細胞數量變化，sHLA-G、IFN-γ 的表達與生殖器皰疹的關系，從而為臨床上病情評估或者早期血清學診斷提供參考，本次研究選取2016年10月～2017年8月在我院接受治療的生殖器皰疹患者為研究對象，探討不同指標的表達情況及其診斷學價值。

1 材料與方法

1.1 一般資料選取2016年10月～2017年8月在我院接受治療的生殖器皰疹患者為研究對象。納入標準：①年齡≥18 歲；②經相關檢查確診為生殖器皰疹者[6]；③無其他免疫系統疾病者。排除標準：①不愿參與本項研究者；②近期合并感染性疾病者。共納入40 例，男24 例，女16 例，年齡29～55歲，平均（42.65±3.19）歲，其中初次發病者30 例，復發者10 例。對照組納入排除標準：①年齡≥18歲；②無嚴重基礎疾病者；③近期未發生感染性疾病，共納入40 例，男20 例，女20 例，年齡25～58 歲，平均（42.71±4.02）歲。兩組研究對象年齡、性別等一般資料比較差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本項研究經醫院倫理委員會評審通過，且所有研究對象均知情同意。

1.2 檢測方法NK細胞檢測：清晨采集空腹靜脈血，按照10 000r/min 的離心速度進行分離，加入5ml 抗凝劑，加入淋巴細胞分離液，按照密度梯度離心法分離淋巴細胞，ARMI 1640 溶液洗滌3 次。采用流式細胞儀雙標法進行CD40+淋巴細胞的檢測。相關標記操作在5ml 抗凝管中進行，100μl 全血與CD3-PE、CD16+、CD56-FITC 抗體室溫反應25min，采用紅細胞裂解液optiLYse C 溶血素溶解紅細胞，PBS 液體洗滌3 遍，每次5min，生理鹽水重新懸浮細胞，上機檢測。FACS calibur 流式細胞儀購自美國BD 公司，流式細胞抗體購自羅氏檢測公司。

采集患者入院后的靜脈血，離心后收集上清液，采用免疫發光法檢測sHLA-G、IFN-γ 水平，檢測儀器為美國Bio-Bad 全自動酶標儀，配套試劑盒購自羅氏檢測公司；采用全自動生化法檢測IL-4、IL-8、IL-12、TNF-α 值，配套試劑盒購自南京碧云天生物檢測公司。

1.3 評價指標觀察兩組患者NK 細胞數量變化及sHLA-G、IFN-γ、炎癥因子水平的差異，探討聯合檢測輔助診斷生殖器皰疹的價值。

1.4 統計學方法數據錄入后，采用SPSS 11.5 軟件進行分析。計數和計量資料分別采用例和均數±標準差表示。兩組研究對象NK 細胞數量變化及sHLA-G、IFN-γ、炎癥因子水平的比較采用t檢驗進行分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者NK 細胞表達水平及sHLA-G、IFN-γ水平的比較觀察組患者NK 數量和IFN-γ 水平低于對照組，sHLA-G 水平高于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組患者NK 細胞表達水平及sHLA-G、IFN-γ 水平的比較

2.2 初次發病和復發組患者NK 細胞數量變化及sHLA-G、IFN-γ水平的比較復發組患者NK 數量和IFN-γ水平低于初次發病組，sHLA-G 水平高于初次發病組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 初次發病和復發組患者NK 數量變化及sHLA-G、IFN-γ 水平的比較

2.3 兩組研究對象炎癥因子水平的比較觀察組患者的IL-4、IL-8、IL-12、TNF-α 水平均高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 兩組患者炎癥因子水平的比較（pg/ml）

2.4 初次發病和復發組患者炎癥因子水平的比較復發組患者的IL-4、IL-8、IL-12、TNF-α 水平均高于初次發病組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表4。

2.5 NK 細胞、sHLA-G、IFN-γ、炎癥因子水平聯合檢測輔助診斷生殖器皰疹的價值NK 細胞、sHLA-G、IFN-γ、炎癥因子水平聯合檢測對生殖器皰疹診斷的靈敏度和特異度高于單項檢測。 見表5。

表4 初次發病和復發組患者炎癥因子水平的比較（pg/ml）

表5 NK 細胞、sHLA-G、IFN-γ、炎癥因子水平聯合檢測輔助診斷生殖器皰疹比較（%）

3 討論

單純皰疹病毒的感染能夠顯著提高生殖器皰疹的發生率，導致患者生殖器黏膜的損害甚至累及其他器官。特別是在具有T 淋巴細胞免疫功能抑制的患者中，生殖器皰疹的發生風險更高，臨床轉歸更差。生殖器皰疹的發生不僅能夠導致局部皮膚黏膜的損害，同時還能夠增加遠期惡性上皮性惡性腫瘤的發生風險[7]。現階段臨床上主要通過抗病毒等方式治療生殖器皰疹，但治療后的病情緩解率仍然較低，遠期的復發率仍較高[8]。臨床上生殖器皰疹治療后的總體有效率不足54%，治療后6 個月內復發率卻超過15%以上[9]。為此本研究通過對血清學免疫功能指標的分析，探討其輔助診斷生殖器皰疹價值。

NK 細胞是患者體內T 淋巴細胞的重要組成成分，能夠通過對于自身吞噬功能及病原體清除功能的調控，提高機體對于單純皰疹病毒的免疫能力。NK 下降導致的T 淋巴細胞功能缺陷，能夠為病毒入侵、整合及擴增等提供條件，從而促進了生殖器皰疹黏膜上皮細胞的病變過程[10]；IFN-γ濃度的維持不僅能夠影響炎癥因子的分泌和釋放，同時還能夠提高樹突狀細胞的功能，提高樹突狀細胞的抗原提呈功能，提高下游CD3+、CD4+T 淋巴細胞的活性，維持患者體內的細胞免疫功能；sHLA-G 是趨化因子家族成員，其羧基末端結構上包含的多個可結合的脯氨酸結構，能夠誘導下游補體成分或者炎癥因子如腫瘤壞死因子的上調，增加生殖器黏膜的炎癥性損傷程度[11]。部分研究者揭示了NK 細胞在生殖器皰疹患者中的數量變化，認為NK 細胞數量的減少能夠促進疾病的發生和臨床治療預后的惡化[12]。

在本次研究中，相關指標的分析可見，NK 細胞的數量、IFN-γ 的表達水平在生殖器皰疹患者中明顯下降，低于對照組人群，差異較為明顯，提示了NK 細胞數量減少、IFN-γ 的表達缺失可能是促進生殖器皰疹發生的原因之一，而sHLA-G 的表達濃度明顯上升，提示sHLA-G 誘導的趨化因子或者炎癥因子的富集可能在促進生殖器皰疹的發生過程中發揮了重要作用[13]。葛幫友等[10]研究也發現，生殖器皰疹患者NK 細胞的數量可平均下降30%以上，特別是在病程較長、生殖器黏膜損傷較為明顯的患者中，NK 細胞數量的下降更為明顯。在復發組患者中，NK 細胞及IFN-γ 的下降或者sHLA-G 的上升幅度更為明顯，提示了相關指標可能在生殖器皰疹的復發過程中發揮了重要調控作用，這主要由于NK 細胞、IFN-γ 的下降能夠導致殘留皰疹病毒顆粒DNA 的擴增及再次激活，而sHLA-G 誘導的局部炎癥性微環境能夠促進殘留單純皰疹病毒的擴散等因素有關。同時作者通過回顧分析不同的文獻，考慮與下列幾個方面的病理改變有關[14，15]：①NK 細胞數量的減少導致體內T 淋巴細胞吞噬分解單純皰疹病毒顆粒的能力下降，皰疹病毒顆粒浸潤導致黏膜上皮細胞的損傷程度明顯增加，從而促進了疾病的復發；②sHLA-G誘導的下游炎癥性信號通路MAPK 的激活，顯著促進了中性粒細胞對于生殖器黏膜的損傷過程，加劇了上皮細胞間質的炎癥損傷，最終促進疾病復發；③IFN-γ 的表達下降使得機體免疫功能下降，對病毒的殺滅不足，導致病毒載量的增加和病情的反復。IL-4、IL-8、IL-12、TNF-α 是體內的炎癥性指標，在病例組及復發性患者中，IL-4、IL-8、IL-12、TNF-α 的表達濃度均顯著上升，特別是復發組患者中的上升更為明顯，提示炎癥性反應是促進患者病情進展和復發的重要風險因素。而最后診斷學方面的研究可見，NK 細胞、sHLA-G、IFN-γ 等在單獨輔助診斷生殖器皰疹方面均具有一定的價值，而聯合不同指標后可以進一步提高靈敏度。

綜上所述，生殖器皰疹患者的NK 細胞數量和IFN-γ 水平較低，sHLA-G 和炎癥因子水平較高，可在結合臨床表現的基礎上，輔助用于疾病診斷。