利用流式細胞法鑒定馬鈴薯倍性方法的優化

王婷婷，張光海，蔡汶玻，郭華春

（云南農業大學，云南 昆明 650201）

流式細胞法（Flow cytometry，FCM）是利用流式細胞分析儀檢測植物細胞DNA含量，分析得到DNA含量直方圖，根據DNA含量直方圖的峰值位置推斷出植株的倍性。由于細胞在有絲分裂的過程中，核內的DNA會進行復制，造成DNA含量的變化。如果把處于G0/G1期的細胞的DNA含量看作2n的話，處于G2/M期的細胞的DNA含量則為4n，所以FCM可以準確快速地鑒定大批量植物材料的染色體倍性水平[1,2]。流式細胞術可以測定液體懸浮液中熒光和微小粒子的光散射（熒光標記的微粒）。由于其快速準確的特點，FCM在20世紀80年代，代替細胞熒光光度法和顯微分光光度測定法，成為測定植物細胞核DNA含量的主流方法，其原理是利用特異的熒光染色劑對細胞進行染色，通過流式細胞儀測定熒光含量[3,4]。由于所使用的熒光染色劑大多為核酸熒光染料，可以與細胞內DNA堿基特異性結合，所以熒光的含量與細胞DNA含量成正比關系，隨著染色體數目的成倍增加，細胞核DNA含量也必然成倍增加，細胞核DNA相對含量的高低與細胞的倍性密切相關，根據細胞核DNA含量的高低可進行倍性鑒定。常用的熒光染料有碘化丙啶（Propidium iodide，PI）、異硫氰基熒光素（Fluorescein isothiocyanate，FITC）和4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）等[5-7]。FCM短時間內可以測定大量的細胞核，樣品需求量小，不會影響植物的正常生長。且樣品制備僅需要幾分鐘，而且不需要昂貴的試劑。流式細胞術簡便、快速、分辨率和準確度高，鑒于這些優點，已經在多種植物的染色體倍性鑒定中得以應用。例如，蘋果[5]、梨[8]、桑樹[9]、菘藍[10]、草莓[11]、 水稻[12]、櫻桃[13]等。

馬 鈴 薯（Solanum tuberosum L.）屬 于 茄 科（Solanaceae）茄屬（Solanum）一年生，草本植物，起源于南美洲的秘魯和智利地區[14]。馬鈴薯普通栽培種分為2個亞種，分別為長日照普通栽培種亞種（S.tuberosum subsp.tuberosum）和短日照安第斯亞種（S.tuberosum subsp.andigena），經過幾個世紀的自然進化選擇，形成了目前世界各國廣泛栽培的普通栽培種（Solanum tuberosum L.）[15]。馬鈴薯倍性豐富，染色體基數為n=12，自然界中分布有二倍體（2n=24）、三倍體（2n=36）、四倍體（2n=48）、五倍體（2n=60）、六倍體（2n=72）[16]。這些是改善栽培馬鈴薯的重要基因資源，可以為育種工作提供具有理想遺傳背景的材料，而馬鈴薯的倍性鑒定則是開展野生種馬鈴薯育種應用研究的基礎和前提[17,18]。

盡管關于馬鈴薯倍性鑒定方法已有很多研究報道，但利用流式細胞法鑒定馬鈴薯倍性方面的報道仍然較少。本試驗借鑒流式細胞法在其他植物染色體倍性鑒定方面的研究，通過篩選適合制備馬鈴薯幼葉單細胞核懸浮液的緩沖液，比較離心和不離心及不同染料對結果的影響，期望利用流式細胞術建立一套適合鑒定馬鈴薯染色體倍性的方法，快速準確地鑒定馬鈴薯倍性，從而為馬鈴薯的倍性研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

二倍體馬鈴薯品系‘E’和四倍體馬鈴薯‘青薯9號’為研究對象，取在MS培養基中正常生長3周左右的幼嫩葉片為試驗材料。流式細胞儀（BD FACSAriaTMⅡ）。

1.2 細胞核分離緩沖液的配制

細胞核分離緩沖液Ⅰ（LB01）：15 mmol/L Tris，2 mmol/L Na2EDTA，0.5 mmol/L腈胺，80 mmol/L KCl， 20 mmol/L NaCl， 0.1%（v/v）Trition X-100，用1 mol/L NaOH調節pH至7.5，0.22 μm濾膜過濾除菌，再加15 mmol/L β-巰基乙醇；分裝后-20℃保存。

細胞核分離緩沖液Ⅱ（Galbraith's buffer）：45 mmol/L MgCl2，20 mmol/L MOPS，30 mmol/L檸檬 酸 鈉 ， 0.1%（v/v）Trition X-100； 用 1 mol/L NaOH調節pH至7.0，0.22 μm濾膜過濾除菌；分裝后-20℃保存。

細胞核分離緩沖液Ⅲ（Tris·MgCl2buffer）：200mmol/L Tris， 4 mmol/L MgCl2， 0.5%（v/v）Trition X-100；用1 mol/L HCl調節pH至7.5，0.22 μm濾膜過濾除菌，4℃保存。

1.3 馬鈴薯葉片細胞核懸浮液的制備

選用上述3種核分離緩沖液，取約20 mg正常生長3周左右的馬鈴薯‘E’組培苗葉片，置于預冷的培養皿中央，加入1 mL預冷的核分離緩沖液，使材料完全浸沒在解離液中，然后用鋒利的雙面刀片迅速切碎，切的過程中樣品應始終接觸緩沖液。將勻漿混勻，避免產生氣泡。將預先浸泡在解離液中400目的濾膜取出，用此濾膜將勻漿過濾到1.5 mL離心管中[19]。

1.4 離心漂洗次數選擇

采用1.3的方法，加入1 mL預冷的LB01緩沖液，分別進行不離心和離心1次的比較試驗。離心1次的試驗條件為4℃，1 000 r/min，離心5 min，棄去上清，再加200 μL LB01緩沖液。

1.5 染色劑的選擇

在用LB01緩沖液制備的單細胞核懸浮液中，分別加入 PI（50 μg/mL）染料和 DAPI（5 μg/mL）染料，注意加PI染料的核懸浮液中要同時加入質量濃度為50 μg/mL的核糖核酸酶（RNase）。4℃避光染色30 min，并輕搖混勻。

1.6 上機檢測與數據分析

用BD FACSAriaTMⅡ流式細胞儀進行檢測，調節參數，每個經過染色的樣品收集10 000個細胞核，利用FlowJo軟件進行數據分析，從而獲得流式峰值圖（橫坐標為細胞核DNA相對含量的熒光強度，縱坐標為細胞核數量）和散點圖（橫坐標為細胞的總熒光強度，縱坐標為細胞通過激光的時間）。

2 結果與分析

2.1 不同緩沖液的效果比較

圖1 不同解離液下二倍體馬鈴薯品系‘E’單細胞核懸浮液的相對DNA含量直方圖和散點圖Figure 1 Peak valuehistogram and scatter diagram ofsinglecellsuspension solution for relativeDNA contentsusing different dissociation buffersin diploid potato line'E'

取約20 mg正常生長3周左右的二倍體馬鈴薯品系‘E’組培苗幼嫩葉片，分別用核分離緩沖液Ⅰ（LB01）、核分離緩沖液Ⅱ（Galbraith's buffer）和核分離緩沖液Ⅲ（Tris·MgCl2buffer）制備馬鈴薯單細胞核懸浮液，檢測結果見圖1。使用3種緩沖液制備的馬鈴薯幼葉細胞核懸浮液，經流式細胞儀檢測均可產生非常明顯的峰。核分離緩沖液Ⅰ（LB01）（圖1-a）的解離效果明顯優于Galbraith's buffer（圖 1-b）和 Tris·MgCl2buffer（圖 1-c）。LB01解離液得到的散點圖中，粒子團清晰、集中，2個細胞群可以完全分開，收集到的完整細胞核較多，在熒光通道值為200處附近出現G1峰，G1峰和G2峰可以完全分開，峰值較為準確（圖1-a-2）。而Galbraith's buffer和Tris·MgCl2buffer制備的核懸浮液中（圖1-b-2和圖1-c-2），2個細胞群不能完全分開，反映在直方圖上則表現為G1峰和G2峰不能完全分開，主峰位置明顯發生偏移。因此，核分離緩沖液LB01可作為制備馬鈴薯幼葉單細胞核懸浮液的最優解離液。

2.2 離心和不離心的效果比較

取二倍體馬鈴薯品系‘E’組培苗新鮮幼嫩葉片制備的馬鈴薯單細胞核懸浮液，進行不離心（圖2-a）和離心1次（圖2-b）的試驗，檢測結果如圖2所示。從圖2-a-2和圖2-b-2看出兩者均表現為粒子團集中、清晰，2個細胞群可以完全分開，反映在直方圖上則表現為G1峰和G2峰可以完全分開，但離心得到的懸浮液中完整細胞核少于不離心得到的。

從提高試驗效率和節約試驗成本來說，應采用不離心的方法制備馬鈴薯單細胞懸浮液。

圖2 不同離心次數制備二倍體馬鈴薯品系‘E’的相對DNA含量直方圖和散點圖Figure 2 Peak value histogram and scatter diagram for relative DNA contents using different centrifugation times in diploid potato line'E'

2.3 不同染料的效果比較

取二倍體馬鈴薯品系‘E’組培苗新鮮幼嫩葉片制備的單細胞核懸浮液，分別用PI（50 μg/mL）染料和DAPI（5 μg/mL）染料進行染色試驗，檢測結果如圖3所示。PI染料和DAPI染料對馬鈴薯單細胞核懸浮液的制備無明顯差異，處理后得到的完整細胞核均較多，粒子團清晰集中，背景碎片少，2個峰可以完全分開。

2.4 馬鈴薯品種‘青薯9號’的倍性分析

圖3 不同染料制備二倍體馬鈴薯品系‘E’幼葉的相對DNA含量直方圖和散點圖Figure 3 Peak value histogram and scatter diagram for relative DNA contents using different fluorescent dyes in diploid potato line'E'

圖4 流式細胞術檢測二倍體馬鈴薯品系‘E’（a）和四倍體品種‘青薯9號’（b）的相對DNA含量Figure 4 Peak value histogram for relative DNA contents of diploid potato line'E'(a)and tetraploid variety'Qingshu 9'(b)by flow cytometry

利用以上所得的最優試驗方案，取大約20 mg正常生長3周左右的‘青薯9號’組培苗幼嫩葉片，置于預冷的培養皿中央，加入1 mL預冷的核分離緩沖液LB01，然后用鋒利的雙面刀片迅速切碎，將勻漿混勻，隨后用預先浸泡在解離液LB01中的400目濾膜將勻漿過濾到1.5 mL離心管中。加入10 μL預冷的質量濃度為50 μg/mL PI的染料，同時加入質量濃度為50 μg/mL的RNase，避光染色30～60 min，最后流式細胞儀上樣檢測。以二倍體馬鈴薯品系‘E’作為對照，將‘青薯9號’的核DNA含量與二倍體馬鈴薯‘E’相比較，結果如圖4。二倍體馬鈴薯‘E’的細胞核熒光強度在200道附近有明顯的峰，而‘青薯9號’在400道附近出現明顯的峰，為二倍體馬鈴薯‘E’的2倍，符合四倍體核DNA的特征。以上建立的方法適合進行馬鈴薯的倍性分析。

3 討 論

在利用流式細胞術鑒定染色體倍性的試驗中，由于只利用物理方法切碎葉片，很難獲得大量的完整的細胞核。因此，還需要加入核分離緩沖液[20]。但是，對于不同科、屬和種的植物來說，在提取單細胞核懸浮液時，需要的解離液也是不同的。如果解離液不適合，會加速細胞核破裂，導致碎片增多。因此，選擇適合本試驗材料的解離液尤為重要。例如，楊靜等[9]利用MgSO4緩沖液成功鑒定了桑樹的染色體倍性；馬艷芝和客紹英[10]利用LB01解離液成功鑒定了菘藍的染色體倍性；在本文中，利用3種核分離緩沖液制備馬鈴薯幼嫩葉片的單細胞核懸浮液，結果表明，解離液LB01的效果最好，所得到的單細胞核懸浮液中，有較多的完整細胞核，而且背景碎片較少，峰圖清晰。另外，LB01緩沖液也適應于蘋果的染色體倍性鑒定[5]。所以，在利用流式細胞術鑒定馬鈴薯染色體倍性時，選擇LB01緩沖液來制備核懸浮液。

由于植物的組織結構不同，會采用不同的離心次數。于紅梅等[11]采用離心2次和離心3次的方法處理草莓單細胞核懸浮液，發現兩者相比，離心3次的效果更好，碎片較少，流式直方圖更清晰，還可以減少對儀器的堵塞。楊靜等[9]比較了不離心、離心1次、離心2次對桑樹染色體倍性鑒定結果的影響，發現3種離心方式對結果并無顯著影響，認為采用不離心的方法制備桑樹的單細胞懸浮液，既可以提高試驗效率又可以簡化試驗操作步驟。吳雅琴等[13]利用流式細胞術鑒定甜櫻桃砧木細胞核DNA含量和染色體倍性的試驗中，采用不離心的方式處理甜櫻桃砧木單細胞核懸浮液，效果顯著，鑒定出了不同砧木品種的倍性。朱道圩等[21]則發現離心2次對中華獼猴桃染色體倍性鑒定效果好。本文比較了不離心和離心1次對馬鈴薯葉片單細胞核懸浮液制備效果的影響，發現離心之后，雖然粒子團也清晰集中，但目的細胞略少于不離心組，可能是離心過程中丟失了部分目的細胞。故選擇不離心的方式制備馬鈴薯葉片單細胞核懸浮液。PI染料不僅可以與DNA結合而且還能與RNA結合，所以用PI進行染色的時候要同時加入RNase。而DAPI僅與DNA結構中的A-T區域結合，與RNA沒有結合位點。從試驗結果來看，2種染料的效果差異不大，所以今后的的試驗既可以選擇PI又可以選擇DAPI作為熒光染料。

在本試驗中，通過對馬鈴薯幼嫩葉片的不同處理與結果分析，總結出一套利用流式細胞術鑒定馬鈴薯染色體倍性的方案：取大約20 mg正常生長3周左右的馬鈴薯組培苗幼嫩葉片，置于預冷的培養皿中央，加入1 mL預冷的核分離緩沖液LB01，用鋒利的雙面刀片迅速切碎，然后將勻漿混勻，用預先浸泡在解離液LB01中的400目濾膜將勻漿過濾到1.5 mL離心管中。加入10 μL預冷的PI（50 μg/mL）染料，同時加入RNase（50 μg/mL），避光染色30～60 min，最后流式細胞儀上樣檢測。

采用流式細胞術鑒定馬鈴薯染色體倍性，所需材料用量少，速度快，短時間內便可鑒定出植株倍性，可以為馬鈴薯的倍性研究提供實驗依據。